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蛋白质微量凯氏定氮法

蛋白质微量凯氏定氮法. 实验目的. 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 掌握凯氏定氮法的操作技术. 实验原理. 1. 有机物中的氮在强热和 CuSO 4 ，浓 H 2 SO 4 作用下，消化生成（ NH 4 ） 2 SO 4. 含氮有机物 +H 2 SO 4 → (NH 4 )SO 4 +CO 2 +H 2 O+ ‥‥. 2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH 3 ，收集于 H 3 BO 3 溶液中。. (NH 4 )SO 4 +NaOH→Na 2 SO 4 +2NH 3 ·H 2 O

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蛋白质微量凯氏定氮法

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Presentation Transcript

  1. 蛋白质微量凯氏定氮法

  2. 实验目的 • 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 • 掌握凯氏定氮法的操作技术

  3. 实验原理 1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4 含氮有机物+H2SO4→(NH4)SO4 +CO2+H2O+‥‥ 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3溶液中。 (NH4)SO4 +NaOH→Na2SO4+2NH3·H2O NH3·H2O-蒸馏→NH3+H2O NH3+H3BO3→(NH4)3BO3

  4. 3. 再用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 (NH4)3BO3 +3HCl→3NH4ClH3BO3

  5. 实验试剂与仪器 实验试剂 • 浓硫酸 • 硫酸钾 • 硫酸铜 • NaOH溶液(30%) • 硼酸溶液(2%) • 盐酸标准溶液（0.01 mol/L ） • 指示剂 :溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成

  6. 各种试剂的作用 （1）浓硫酸： A：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2 B： 氧化 C： 蛋白质与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O D： NH3与H2SO4生成硫酸铵 （2）CuSO4的作用（催化剂） （3）K2SO4的作用（提高沸点） 沸点由330℃提高到400℃加速了消化过程。

  7. 实验仪器: 凯氏烧瓶（100ml） 1只 凯氏定氮装置 1套 移液管(10ml) 1支 酸式滴定管 1支 容量瓶(100ml) 1只 三角瓶(150ml) 2只 量筒(50mL,100ml) 各一只 漏斗 1只

  8. 实验步骤 一、 消化 称取样品0.5~1g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止. 冷却，转入100ml容量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

  9. 二 蒸馏器清洗 图中所示的蒸馏器使用方法如下: 开放自来水龙头,使水从E进入G,从K流出,(水不宜开得过大以免水从G溢出).开放P3使水进入A,从漏斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指将G管口掀紧.同时开放P1则B中水从Y型管中冲出.随后A中水经K流出.一般情况下,如此重复洗涤两次即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml后蒸馏一次方可使用.

  10. A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收

  11. 三 氨的吸收 1 、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可. 2 、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加2~3滴混合指示剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层. 3 、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗,夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失. 4 、用电炉加热,待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起计时,继续蒸馏5min,然后将锥形瓶放低,使M管离开液面再蒸馏2min,最后用蒸馏水洗导管外壁.取出锥形瓶,随即将蒸馏器洗净

  12. 四、滴定 用0.01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止,记录滴定所用HCl的量 五、重复实验及空白实验 六、蛋白质含量的计算 试样中蛋白质的含量=(V1-V2) ×HClmol/L× 0.014× 20× 6.25×100% /W V1:滴定试样时用去的HCl的ml数 V2:滴定空白时用去的HCl的ml数 mol/L:HCl的摩尔浓度 W:试样的重量 0.014:氮的毫摩尔 6.25: 氮换算成蛋白质的系数 20: 稀释倍数

  13. 实验注意事项 a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。 b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被检样消化不完全，使结果偏低。 c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小火加热,并时时摇动。 d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.

  14. e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色.e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色. f.硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失. g.蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面,再蒸2min后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。 思考题：分析本测定方法产生误差的可能原因

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