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ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS

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  1. ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS CONSIDERACIONES GENERALES

  2. PROTEÍNAS • SON COMPONENTES ABUNDANTES EN TODAS LAS CÉLULAS. • CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE ALMACENAMIENTO) SON IMPORTANTES PARA LAS FUNCIONES BIOLÓGICAS Y/O LA ESTRUCTURA CELULAR. • LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY COMPLEJAS.

  3. COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS • ESTÁN CONSTITUÍDAS POR: HIDRÓGENO, CARBONO, NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE. • LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS PROTEÍNAS SON 20 ∞-AMINOÁCIDOS. • LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS EN UNA PROTEÍNA SON ENLACES PEPTÍDICOS.

  4. COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS • EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO PRESENTE EN LAS PROTEÍNAS. • GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN AMINOÁCIDOS BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO. • SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN VARIAS PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4 19.1% DEBIDO A LA VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.

  5. CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS • COMPOSICIÓN • ESTRUCTURA • FUNCIÓN BIOLÓGICA • PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD

  6. COMPLICACIONES EN ELANÁLISIS DE PROTEÍNAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS DE LOS ALIMENTOS SIMILARES A LOS DE LAS PROTEÍNAS

  7. FUENTES DE NITRÓGENO NO PROTÉICO • AMINOÁCIDOS LIBRES • PEQUEÑOS PÉPTIDOS • ÁCIDOS NUCLÉICOS • FOSFOLÍPIDOS • AZÚCARES AMINAS • PORFIRINA • ALGUNAS VITAMINAS

  8. FUENTES DE NITRÓGENONO PROTÉICO • ALCALOIDES • ÁCIDO ÚRICO • UREA • IONES DE AMONIO

  9. OTROS MACROCOMPONENTES DE LOS ALIMENTOS QUE PUEDEN INTERFERIR CON EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS • LÍPIDOS • CARBOHIDRATOS

  10. MÉTODOS DESARROLLADOS PARA MEDIR EL CONTENIDO PROTÉICO FUNDAMENTOS: • DETERMINACIONES DE NITRÓGENO • ENLACES PEPTÍDICOS • ÁCIDOS AROMÁTICOS • ABSORTIVIDAD UV DE LAS PROTEÍNAS • GRUPOS AMINO LIBRES • PROPIEDADES DE DISPERSIÓN DE LA LUZ • CAPACIDAD DE ADHESIÓN DE COLORANTES

  11. IMPORTANCIA DEL ANÁLISISDE PROTEÍNAS • DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA. EJEMPLO: PECTINASAS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS. • INVESTIGACIÓN SOBRE PROPIEDADES FUNCIONALES. EJMPLO: GLIADINA Y GLUTENINAS PARA LA ELABORACIÓN DEL PAN. • ETIQUETAMIENTO NUTRICIONAL

  12. NECDESIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS • CONTENIDO PROTÉICO TOTAL • COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS • CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA PARTICULAR EN UNA MEZCLA • CONTENIDO PORTEÍCO DURANTE EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA • NITRÓGENO NO PROTÉICO • VALOR NUTRITIVO DE UNA (DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTÉICO)

  13. CONTENIDO PROTÉICOEN LOS ALIMENTOS • PRODUCTOS LÁCTEOS LECHE ENTERA 3.5% LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA 35.9% QUESO CHEDDAR 25% • HUEVOS 12.9%

  14. CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • CARNES RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6% PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO 17.1% PECHUGA DE POLLO 27.3% • PESCADO BACALAO COCINADO 28.5% ATÚN EN ACEITE ENLATADO 24.2%

  15. CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • CEREALES ARROZ, INTEGRAL, CRUDO 7.5% ARROZ REFINADO, CRUDO 6.7% HARINA DE TRIGO INTEGRAL 13.3% HARINA DE MAÍZ 7.8% SPAGHETTI, SECO 12.5% ALMIDÓN DE MAÍZ 0.3%

  16. CONTENIDO PROTÉICO ENLOS ALIMENTOS • FRUTAS Y VEGETALES PAPA ENTERA, CRUDA 1.6% ESPÁRRAGOS VERDES 2.5% TAPIOCA 0.6% FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES 22.3% SOYA SECA 34.1%

  17. CONTENIDO PROTÉICO EN LOSALIMENTOS • FRUTAS Y SEMILLAS MANZANA ENTERA, CRUDA 0.2% ALMENDRAS ENTERAS 18.6%

  18. MÉTODOS DE DETERMINACIÓNDE PROTEÍNAS • MÉTODO DE KJELDAHL • MÉTODO DE BIURET • MÉTODO DE LOWRY • MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nm • MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE • MÉTODO DE BRADFORD • MÉTODO DE LA NINHIDRINA • MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

  19. MÉTODO DE KJELDAHL(JOHANN KJELDAHL, 1883) • DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN DEL NITRÓGENO A SULFATO DE AMONIO. • NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E YODATO. • TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO ESTÁNDAR

  20. MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA DIGESTIÓN COMPLETA. EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.

  21. MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL ÁCIDO SULFÚRICO PARA ACELERAR LA DIGESTIÓN. • EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR AMONIO.

  22. MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES SEGUIDO DE UNA TITULACIÓN CON UN ÁCIDO ESTÁNDAR. • SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE NITRÓGENO POSTERIOR A LA DIGESTIÓN.

  23. PROCEDIMIENTO GENERALY REACCIONES • DIGESTIÓN EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO. DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO PROTÉICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO. EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y SE COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.

  24. PROTEÍNA (NH4)2 SO4 Ácido Sulfúrico Calor, catalizador DIGESTIÓN • LOS ELEMENTOS CARBONO E HIDRÓGENO SE CONVIERTEN EN DIÓXIDO DE CARBONO Y AGUA

  25. NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN • LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA. • SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE TIOSULFATO DE SODIO PARA NEUTRALIZAR AL ÁCIDO SULFÚRICO. • EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE LOS INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO DE METILO.

  26. REACCIONES DE LANEUTRALIZACIÓN Y LA DESTILACIÓN (NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O NH3+ H3BO3 → NH4 + H2BO3- (ácido bórico) (ión borato)

  27. REACCIONES DE LATITULACIÓN • EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA CON HCl ESTANDARIZADO: H2BO3- + H+→ H3BO3

  28. CÁLCULOS MOLES DE HCl = MOLES DE NH3 = MOLES DE NITRÓGENO EN LA MUESTRA

  29. FUNCIÓN DEL BLANCO EN LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS • SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON REACTIVOS PARA SUSTRAER EL NITRÓGENO REACTIVO DEL NITRÓGENO DE LA MUESTRA.

  30. N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL • VOL. ÁCIDO CORREGIDO = mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA LA MUESTRA) – (mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA EL BLANCO) • 14 = PESO ATÓMICO DEL NITRÓGENO %N = N HCl X VOLUMEN DE ÁCIDCORR. g. DE MUESTRA X 14g N2 X 100 MOL

  31. FACTOR • SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIÓN DE % DE N2 A % DE PROTEÍNA CRUDA. • LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS CONTIENEN 16% DE N2 • EL FACTOR DE CONVERSIÓN ES: 6.25 (100/16 = 6.25) %N2 X 6.25 = %PROTEÍNA Ó %N2= %PROTEÍNA 0.16

  32. FACTORES DE CONVERSIÓNPARA ALGUNOS ALIMENTOS ALIMENTO %N2PROTEÍNA FACTOR HUEVO O 16 6.25 CARNE, MAÍZ LECHE 15.7 6.38 TRIGO 18 5.7 SOYA 17.51 5.71 AVENA 17.15 5.83

  33. PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN • NESSLERIZACIÓN NH4OH + 2HGI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I + 7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm) RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO DIMERCÚRICO DE AMONIO ES COLOIDE Y EL COLOR ES INESTABLE

  34. PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN • MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO BÓRICO • MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO, MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA IÓNICA

  35. VENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL • APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS • RELATIVAMENTE SIMPLE • BARATO • PRECISO • ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR EL CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA

  36. DESVENTAJAS DEL MÉTODODE KJELDAHL • MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL, NO SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO • CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2 HORAS PARA COMPLETARSE) • PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO DE BIURET • USA REACTIVOS CORROSIVOS

  37. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET • FUNDAMENTO AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETA-MORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm. LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.

  38. PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET • 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL). EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IÓN COBRE EN LA SOLUCIÓN ALCALINA

  39. PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET • DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO. • SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA ABSORBANCIA

  40. PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET • SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO

  41. VENTAJAS DEL MÉTODO DE BIURET • MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL • RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS) • ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS • NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR • POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET • NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS

  42. DESVENTAJAS DEL MÉTODO DEBIURET • NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY • REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA • LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN FINAL SI ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LÍPIDOS O CARBOHIDRATOS • DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS

  43. MÉTODO DE LOWRY • FUNDAMENTO COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA REDUCCIÓN DEL REACTIVO DE FENOL FOLIN-CIOCALTEAU (ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICO-FOSFOTÚNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA Y TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS. EL COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES LEÍDO A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA BAJA) O A 500nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA ALTA)

  44. VENTAJAS DEL MÉTODO DE LOWRY • MUY SENSIBLE • MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA • MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOS • RELATIVAMENTE SIMPLE • SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS

  45. DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELOWRY • EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET) • EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS • LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

  46. MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • FUNDAMENTO SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA

  47. VENTAJAS DEL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg) • LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY • EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY • LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)

  48. DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA. • LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN. • ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN. • LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL

  49. MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280nm • FUNDAMENTO LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE BEER

  50. MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280nm • FUNDAMENTO DADO QUE CADA PROTEÍNA TIENE UNA COMPOASICIÓN ÚNICA DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (E280) O SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN SER DETERMINADOS PARA PROTEÍNAS INDIVIDUALES PARA LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO