× ×•×©× 3

1. שלב I : הכנות לתהליך הייצור נושא 3 תהליך תסיסה להפקת תוצר בקנה-מידה גדול מתנהל כתהליך ייצור תעשייתי על-פי שלושת השלבים : ( I ) שלב ההכנות , ( II ) שלב הייצור , ( III ) שלב הפקת התוצר. שלב ההכנות כולל : 3 2 1 שיטות עיקור והבטחת סטריליות הכנת תרבית המזרע (אינוקולום) הכנת מצע הגידול (חומרי המזון)

2. 1. הכנת מצע המזון לגידול מיקרואורגניזם היצרן יסודות קורט מינרלים מקור גופרית מקור זרחן מקור חנקן מקור פחמן ואנרגיה מים ( 80% ) להמסת המרכיבים וקבלת תמיסת מזון קבלת ביומסה גידול והתרבות התאים http://random1881.files.wordpress.com/2008/12/e_coli.jpg

3. מקור פחמן ( C ) ואנרגיה • פחמימות ושומנים דרושים למיקרואורגניזמים כדי לספק פחמן לבניית תרכובות אורגניות וגם מקור לאנרגיה. מקור הפחמן עובר עיבוד אנזימי מקדים כדי שיהיה זמין לתהליך התסיסה. • פחמימות: • גלוקוז מעמילן תירס. עמילן הוא רב-סוכר. נדרש עיבוד מקדים כמו פירוק אנזימי ע"י עמילאזות לגלוקוז כדי שיהפוך זמין לתאים. • גלוקוז ממולסה. מולסה היא תוצר לוואי בתעשיית הסוכר והיא עשירה בסוכרוז (דו-סוכר). נדרש פירוק אנזימי של הדו-סוכר ע"י אינברטאז לגלוקוז ופרוקטוז. שומנים: • תרכובות שומניות: פחמימנים (נפט) , שומנים צמחיים (סויה, חמניות). נדרש פירוק אנזימי ע"י ליפאזות כדי להפוך למקור זמין לתאים. • גליצרול וכוהלים • מי גבינה (תוצר לוואי בתעשיית החלב)

4. חסרונות השומנים בהשוואה לפחמימות כמקור אנרגיה • השומנים בלתי מסיסים בתמיסה מימית. לכן נדרש להפוך אותם לתחליב ע"י שבירתם לטיפות שומן זעירות ופיזורן בממיס המימי, והגדלת שטח המגע בינם לבין התאים. • פירוק שומנים להפקת אנרגיה מלווה בפליטת חום גדולה יותר בגלל תכולת חמצן נמוכה יותר במולקולות (בהשוואה לפחמימות). זה מצריך מערכת קירור חזקה יותר. • פירוק שומנים דורש אספקת חמצן גדולה יותר למערכת הגידול בגלל שמכילים פחות אטומי חמצן במולקולות.

5. מקור חנקן ( N ) • החנקן דרוש למיקרואורגניזמים לבניית חלבונים, DNA , RNA וקו-אנזימים הדרושים לתהליכים ביוכימיים. • מקורות אנאורגניים: • אמוניה ( NH3 ) • מלחי אמוניה • מלחי ניטראט מקורות אורגניים: • חלבוני תירס, חלבון סויה. נדרש טיפול מקדים אנזימי ע"י פרוטאזות כדי להפוך למקור זמין לתאים. • חומצות אמיניות • פפטידים. נדרש פירוק מקדים ע"י פפטידאזות.

6. מקור זרחן ( P ) • זרחן דרוש למיקרואורגניזמים לבניית פוספוליפידים, חומצות גרעין DNA ו- RNA וגם ליצירת מערכת בופר לאיזון ה- pH . • מלחי פוספט (זרחן) מסיסים. • מקור גופרית ( S ) • גופרית דרושה למיקרואורגניזמים לבניית חלבונים . • מקורות אנאורגניים: • מלחי סולפאט. • סולפידים מקורות אורגניים: • חומצה אמינית ציסטאין ומתיונין המכילות גופרית .

7. מינרלים (מלחים) • מלחים אנאורגניים מסיסים המשמשים קו-פקטורים (סייענים) של אנזימים: • מלחי ברזל ( Fe ) • מלחי סידן ( Ca ) • מלחי מגנזיום ( Mg ) • מלחי אשלגן ( K ) • יסודות קורט ( יסודות הדרושים בכמויות זעירות) • מלחים אנאורגניים מסיסים המרכיבים אנזימים : • אבץ ( Zn ) • קובלט ( Co ) • נחושת ( Cu ) • מנגן ( Mn ) • מוליבדן ( Mo )

8. פקטורי גידול • פקטורי גידול: תרכובות אורגניות המצויות בתמצית ממקור חי. • תמצית מן החי: תערובת עשירה בתרכובות אורגניות, הדרושות לגידול המיקרואורגניזם, ואינו יכול ליצור אותן בעצמו ולכן דרושה אספקה מבחוץ. מרכיבי התערובת מכילים פקטורי (גורמי) גידול שבלעדיהם המיקרואורגניזם לא יכול לגדול. לדוגמה: • תמצית שמרים • תמצית לתת • תמצית סויה התרכובות האורגניות בתמצית הנחוצות לגידול כוללות בעיקר שלוש קבוצות : • תערובת חומצות אמיניות הנחוצות לבניית חלבונים. • תערובת בסיסים חנקניים (פורינים ופירימידינים) לבניית חומצות גרעין DNA ו- RNA. • ויטמינים המשמשים קו-אנזימים (סייענים) לפעילות אנזימים.

9. סוגים של מצעי גידול מצע מורכב מצע עשיר בעל הרכב כימי לא ידוע במדויק, המכיל תמצית מן החי (תמצית של שמרים, או לתת, או סויה) המספקת את פקטורי גידול הדרושים לגידול התאים. מצע פשוט מצע בעל הרכב כימי ידוע ומוגדר (לא מכיל תמצית מן החי). מקור חמצן ( O2 ) אוויר סטרילי משמש מקור לחמצן בתהליכים אירוביים. כדי שהחמצן יהיה זמין לתאים עליו להפוך להתמוסס תחילה בנוזל התסיסה ולהפוך לחמצן מסיס ורק אז התאים יכולים לקלוט אותו לתוכם.

10. 2. הכנת תרבית המזרע ( Seed Culture) גידול המיקרואורגניזם היצרן לקבלת אינוקולום תרבית מזרע: תרבית אחידה וטהורה של תאי מיקרואורגניזם הנמצאים בתהליך גידול והתרבות, בכמות מספקת "לזריעה" בפרמנטור התסיסה וקבלת ביומסה לייצור התוצר. תרבית מזרע מכינים מתרבית מוצא. תרבית מוצא: תרבית טהורה מיובשת בהקפאה של זן אחד של מיקרואורגניזמים, שמורה ומאוחסנת במבחנת סטוק (Stock), בתנאי קירור. התאים נמצאים בכמות קטנה ובמצב של אי פעילות (תרדמה) . כדי "להחיות" את תרבית המוצא ולקבל ממנה תרבית מזרע המתאימה מבחינה כמותית לפרמנטור התסיסה, מבצעים תהליך גידול הדרגתי ורב-שלבי .

11. הכנת תרבית המזרע ( Seed Culture ) גידול הדרגתי רב-שלבי זריעת התאים תרבית מוצא (סטוק) תרבית תאים מוקפאת בתרדמה במבחנות ארלנמייר מיטלטל החייאת התאים וגידול ראשוני של התאים בנפח קטן של מצע נוזלי עשיר ובטלטול לקבלת שלב גידול מואץ פרמנטור ייצור פרמנטור התסיסה התאים הנזרעים בו נמצאים במצב פיסיולוגי מתאים לתסיסה ובשלב גידול מואץ. הודות לכך, זמן המחזור מתקצר ויעילות הייצור גדולה יותר. פרמנטור מזרע I תרבית ביניים בתהליך גידול מואץ בנפח מוגדל של מצע הזהה למצע בפרמנטור הייצור לקיצור שלב ההסתגלות פרמנטור מזרע II תרבית סופית בכמות מתאימה בשלב גידול מואץ בנפח מוגדל של מצע הזהה למצע בפרמנטור הייצור לקיצור שלב ההסתגלות מספר שלבי הביניים של פרמנטור מזרע תלוי בגודל הביומסה הסופי הנדרש לפרמנטור הייצור

12. תרבית מוצא (סטוק) אחסון תרביות מוצא (סטוק) נעשה בשתי שיטות • שמירה לטווח זמןקצר : • על ידי גידול התאים על מצע מזון מוצק בצלחות פטרי ושמירתם בתנאים סטריליים בקירור ב 4 מעלות וביצוע העברות חוזרות. • שמירה לטווח זמןארוך : • על ידי ייבוש התאים והרדמתם בהקפאה, ושמירתם בתנאי ואקום באמפולות זכוכית קטנות ואטומות בטמפרטורה נמוכה מ -20 ועד -70 מעלות תאים חיים פעילים שמורים לזמן קצר תאים חיים מוקפאים שמורים לזמן ארוך http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/93/Agar_plate_with_colonies.jpg/220px-Agar_plate_with_colonies.jpg http://www.rapidmicrobiology.com/news/220h31.php

13. 3. עיקור המערכת (סטריליזציה) כדי להבטיח שאין תאים או נבגים של מיקרואורגניזמים אקראיים ולא רצויים בתהליך התסיסה יש לדאוג שמערכת הייצור תהיה סטרילית ונקייה מזיהומים ע"י שימוש ב : תרבית תאים טהורה של מיקרואורגניזמים (ללא זיהום במיקרואורגניזמים זרים אחרים) אוויר סטרילי הזרמת אוויר לפרמנטור דרך מסנן תת-מיקרוני שלא מחדיר מיקרואורגניזמים פרמנטורים וצינורותסטריליים שעברו עיקור באדי קיטור מצע מזון (חומר גלם) וציוד סטריליים שעברו עיקור בשיטות שונות • עיקור ציוד וחומרים יכול להתבצע ע"י : • חימום בלחץ עם אדי קיטור 121 מ"צ למשך 20 דקות (בתנאים אלה יש גם השמדת נבגים לא רצויים). • סינון תת-מיקרוני שלא מחדיר מיקרואורגניזמים . הסינון מתאים לתמיסות המכילות מרכיבי מזון רגישים לחימום • העיקור חשוב כי זיהום יכול להפריע ע"י : • תחרות על מרכיבי המצע ועיכוב הגידול. • הרס התוצר הרצוי. • יצירת תוצרי לוואי. אוויר סטרילי משמש מקור לחמצן בתהליכים אירוביים

14. סרטון של שלב ההכנות ( לפתוח שלב הנקרא : Upstream processing) http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/shoeb/fermenter-main.html

15. כתבות / מאמרים / אתרים בנושא הפרק - סרטון על שלב I : שלב ההכנות ( לפתוח את השלב הנקרא : Upstream processing ) http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/shoeb/fermenter-main.html - תסיסה : מיקרוביולוגיה תעשייתית (פרמנטציה) http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/industrial-microbiology.htm http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/fermentation.htm http://books.google.co.il/books?id=E3bvD2jU4B0C&pg=PA48&lpg=PA48&dq=inoculum+fermentor&source=bl&ots=1lVkFSNpNP&sig=XTs7BylVFTUolvR8x5M0yeCcvAc&hl=iw&ei=GQFASqaDN4WqsAbqpJnUDw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1 • הגדרת ביוריאקטור • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/bioreactors.htm • מצע גידול (מדיום ) • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/culture-media.htm • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/bioreactor-media.htm • ביוטרנספורמציה • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/biotransformation.htm

16. תרבית מזרע (אינוקולום) • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/inoculum-development.htm • http://books.google.co.il/books?id=E3bvD2jU4B0C&pg=PA48&lpg=PA48&dq=inoculum+fermentor&source=bl&ots=1lVkFSNpNP&sig=XTs7BylVFTUolvR8x5M0yeCcvAc&hl=iw&ei=GQFASqaDN4WqsAbqpJnUDw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1 • תרבית מוצא (סטוק) • http://www.rapidmicrobiology.com/test-methods/Culturestorage.php • זיהום • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/contamination.htm • עיקור • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/sterilization.htm • שיטות עיקור • http://www.molecular-plant-biotechnology.info/industrial-microbiology/sterilization-procedures.htm • מולסה ( Molassa ) • http://www.efind.co.il/Detailed/56551.html • http://www.sakeret.com/%D7%A1%D7%9B%D7%A8%D7%AA/%D7%9E%D7%96%D7%95%D7%A0%D7%95%D7%AA/%D7%9E%D7%95%D7%9C%D7%A1%D7%94