EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR EN UN HOSPITAL COMARCAL

1. EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR EN UN HOSPITAL COMARCAL Dr. Ricardo Molina Gasset, Mayo 2012

2. Estudios sobre la alcaptonuria A. Garrod 1902 Beadle y Tatum Hipótesis "un gen-un enzima" Beadle y Tatum 1945 Bases moleculares de la anemia falciforme Pauling e Ingram 1949 Estructura de doble hélice del DNA Watson y Crick 1953 Técnicas de DNA recombinante varios 1960-80 Técnicas de secuenciación del DNA Maxam y Gilbert/Sanger 1977-80 Técnica de PCR Mullis 1985 Proyecto Genoma Humano varios 1990-04 Proyecto HapMap varios 2002- Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing) varios 2008-

3. Proyecto del genoma humano (2000) revolucionó la manera en la cual los científicos estudian los mecanismos moleculares de la enfermedades • De 100,000 to 23,000 genes. • Tests que identifican marcadores moleculares y genéticos de forma individual. • Esos marcadores determinan el beneficio potencial de una terapia específica o el riesgo de desarrollar una enfermedad u otra condición de salud

5. Industria del diagnóstico molecular $5.5 Billones en el 2009 $8 Billones para el 2010 40 millones de test anuales en USA. En el futuro próximo serán 1/3 de todos los test diágnosticos

6. 55% - Enfermedades infecciosas • 23% - Cribado sanguineo • 7% - Cancer Predicción de riesgos – Oncotipos. Detección temprana – Cromosoma X fragil. Clasificación de enfermedades – Leucemias. Terapia dirigida a determinadas dianas. Predicción de toxicidad y respuesta – Herceptin (Herp2). 13% - Test genéticos

7. BIOLOGÍAMOLECULAR Disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular Procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisión de la información genética en la célula La medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las técnicas de la biología molecular en el estudio de las enfermedades humanas.

8. Dogma central de la biología molecular

9. Según el tipo de célula Germinales Somáticas (cáncer) Mutaciones puntuales Inserciones y delecciones Génicas Según el tipo de alteración numéricas estructurales Cromosómicas Autosómicas Ligadas al sexo nucleares Según el genoma y cromosoma afectados mitocondrial CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales.... Genéticas Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas

10. Biología molecular en las ciencias médicas • La medicina molecular • La medicina genómica • El diagnóstico molecular • La farmacogenómica • La terapia génica • Avance en: • Conocimiento de la patogenia de las enfermedades • Desarrollo de novedosas estrategias terapéuticas • Mejora de tratamientos farmacológicos • Implementación de métodos diagnósticos precisos y exactos

11. La medicina molecular Todas las enfermedades humanas poseen un componente genético bien hereditario o como resultado de la respuesta del organismo a los estímulos del medio, como las toxinas o los virus El genotipo relacionado con la génesis y evolución de la enfermedad. Con el conocimiento de las bases moleculares de las enfermedades es posible Identificar marcadores para el diagnóstico temprano Nuevos blancos terapéuticos Desarrollar estrategias terapéuticas novedosas y efectivas que en su conjunto permitan mejorar la atención a la salud

12. Variaciones genotípicas: variaciones en la secuencia del DNA Diferencias fenotípicas: Las diferencias morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y moleculares entre individuos de la misma especie Cambios en la secuencia del DNA con una incidencia > 1% Cambios en la secuencia del DNA con una incidencia < 1%. Polimorfismos (SNPs (polimorfismos de una sola base) explican alrededor del 90% de la diversidad fenotípica en el humano. Mutaciones

13. Medicina genómica Estudio de los polimorfismos y su asociación con las enfermedades Susceptibilidad genética Polimorfismos que confieren propensión genética al desarrollo o complicaciones de ciertas enfermedades Predicción con cierta exactitud los riesgos de padecer enfermedades donde los genes jueguen un papel fundamental Predicción de evolución de la enfermedad y su respuesta a las terapias farmacológicas Aplicación de medidas preventivas que limiten o incluso eviten la enfermedad y mejora en los tratamientos

14. Dot Blot Diagnóstico Molecular. Las técnicas generadas por la Biología Molecular ofrecen ventajas sobre las técnicas convencionales en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y adquiridas.

15. ¯ Dosis ­ Dosis No responde Muy poco Farmacogenómica Se trata una enfermedad, no al individuo. Responde Responde No responde Muy poco Toxicidad Responde

16. RESPONDEDORES NO RESPONDEDORES Un medicamento funciona bien en una persona pero poco o nada en otra con la misma patología. EFECTOS SECUNDARIOS ADVERSOS Unas personas los toleran bien mientras que otras desarrollan efectos adversos.

17. FACTORES QUE CONDICIONAN ESTA RESPUESTA DIFERENCIAL EDAD SEXO, PESO ENFERMEDADES GENES INTRÍNSECOS ESTADO NUTRICIONAL HÁBITOS DE VIDA (DIETA, TABAQUISMO, ALCOHOL, DROGAS) AMBIENTE OTROS MEDICAMENTOS EXTRÍNSECOS

18. Farmacogenómica: Evalúar la influencia de los polimorfismos genéticos en la respuesta a los fármacos Reacciones individuales tanto terapéuticas como toxicas Las evaluaciones farmacogenómicas permiten aumentar la eficiencia y bioseguridad de los tratamientos farmacológicos para generar un tratamiento justo a la medida del genotipo.

19. CYP2C9/10 CYP21A2 CYP2D6 CYP2A6 CYP2C19 CYP2E1 CYP3A Vía principal en elmetabolismode los fármacos Oxidaciónpor familia de enzimas hepáticas:CYP450 Proporción de fármacos Metabolizados por algún miembro de P450

20. Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador Fenotipo metabolizador Genotipo Tipo de respuesta a dosis típicas Ultrarápido = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Conc. Tiempo Actividad normal Actividad reducida Eficiente = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Intermedio = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo no actividad Lento = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo

21. Familia CYP2

22. Farmacogenómica: Enzimas citocromo P450Se ha estimado que una dosis diaria de 10-20 mg de nortriptilina es suficiente para un paciente metabolizador lento CYP2D6 y, sin embargo, un metabolizador ultrarrápido que herede múltiples copias del gen requeriría más de 500 mg al día Enzimas glutatión S-transferasas Numerosos estudios reportan asociación entre los polimorfismos en los genes GST y la eficacia y/o toxicidad en la quimioterapia del cáncer

23. TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

24. Hemocromatosis: Grupo de trastornos caracterizados por depósito de hierro en el organismo • Hemocromatosis hederitaria: Grupo de trastornos genéticos caracterizados por aumento en la absorción intestinal y depósito de hierro en el organismo • Mayoría: mutación gen HFE 80-90% homocigotos para mutación C282Y

25. Causas de sobrecarga de hierro

27. Disminución de Hepcidina por mutación HFE MUTADO

28. Autosómica recesiva. 3 mutaciones gen de HFE (brazo corto crom. 6) • C282Y(Cys por Tyr). La principal • No se une a la b2M y no se expresa en membrana. • Alta penetrancia para homocigotos. Más en > 40 años. Más en hombres. • Incluso para homocigotos C282Y de > 40 años, aunque la sobrecarga férrica es habitual (♀: 80% - ♂: 95%), no lo es la sintomatología (♀:13% - ♂:15%). • H63D (Hys por Asp) • Se altera la estructura terciaria, se expresa en membrana y se une a B2M, no es capaz de bloquear la unión HFE- sTfR. • Solo tienen penetrancia relevante (aunque menor que en el caso anterior) si son heterocigotos mixtos con C282Y. • S65C (Ser por Cys). La menos importante • Pese a que se expresa en membrana y se une a B2M, está afectada la zona de unión entre HFE y sTfR. • Solo tienen algo de penetrancia (< 1%) en heterocigosis mixta con C282Y. Se llama, también, mutación benigna. Muy poco prevalente en España.

29. Enfermedad genética más frecuente en Occidente • Portadores 10% • Prevalencia de HH: 1/200-400 europeos caucásicos • Europa: • Norte: 80-90% C282Y-C282Y • Cuenca mediterránea: 50-70% C282Y-C282Y • Mayoría asintomáticos • 40 – 50 años • 10 ♂: 1♀

30. Cribado del gen de la hemocromatosis en el laboratorio • Campo de aplicación: pacientes de primaria • Ferritina > 400 en dos análisis • Reactantes de fase aguda negativos (PCR < 0.5) • Marcadores Hepatitis negativos • Enzimas hepaticas no mayores de 200 • Hemoglobina > 12 mujeres o 13 hombres (descartar anemias hemoliticas, sideroblasticas o megaloblasticas)

34. Prevalencia en España de los genotipos HFE Prevalencia de la población estudiada en Alcoy de los genotipos HFE

35. TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FV Leiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

36. Trombofilias hereditarias • Resistencia a la PCa (FV Leiden) • Aumento de Protombina (G20210A) • Hiperhomocisteinemia

37. VE Daño Vascular VI XII colágenoXIIa FT VII VIIa VIIa-FT Calicreína PK HMWK VIII XI XIa HMWK Ca+2 IXCa+2IXa-VIIIa Resistencia a la PCa y Factor V Leiden Sist. PC Se inactiva por rotura de su cadena pesada por el complejo PCa (rotura Arg506) Mutación de guanina por adenina en nucleotido 1691 (FVleiden), cambia Arg506 por Glut y se hace resistente a la acción de la PCa cofactor de conversión de protombina a trombina V se activa por la trombina Ca+2 X Xa-Va Protombina Trombina Fibrinógeno Fibrina Fibrina estable XIII XIIIa Ca+2 Ca+2

38. Resistencia a la PCa • 20-25% de las trombosis venosas (Casos seleccionados) • Mutación en el gen del FV (FV Leiden) G1691A A A A C C PcaTrombina FV Leiden: • Menos sensible a la degradación por PCa • Actividad procoagulante aumentada Gen FV, crom 1, 25 exones COOH H2N Arg Arg Glu

39. Factor V LeidenApacere en:-Heterozigosis (95% casos)-Homozigosis (1% casos)-FV leiden + déficit FV (pseudohomozigotos) -Mayor riesgo si aparece junto a déficit de PS, PC, AT, polimorfismo de la protombina, niveles elevados FVIII, hiperhomocistinemia, embarazo, anticonceptivos orales, terapia hormonal sustitutoria -Factor de riesgo genético para trombofilias, mas frecuente en paises occidentales -Homozigotos tienen clínica de trombosis venosa-Heterozigotos suelen ser asintomáticos

40. Polimorfismo A POLIMORFISMO de la Protrombina E1 E14 5´ 3´ G 20210 Genotipo 20210G Genotipo 20210A [ Protrombina ] en plasma 1,32 U/ml 1,05 U/ml Riesgo Coagulación normal

41. Polimorfismo G20210A del Gen de la Protombina 5´ 3´ Gen de Protombina, 14 exones G20210A Síntesis de Protombina (mayor nivel en plasma; 30%) • Asociación con trombosis venosa y tromboembolismo pulmonar • 3-6 veces el riesgo de T. venosa ( asociado a ACO)

42. Homocisteína (Hcy) • Aminoácido tiól • No esencial • Intermediario en el metabolismo de la Metionina

43. (MTHFR) B12

44. 5,10 Metilentetrahidrofolato Reductasa (MTHFR) MutaciónC677TAla Val MTHFR termolábil de Homocisteína plasmática (pHcy) Factor de riesgo de Trombosis Enzima con menor actividad 30-40% menos en heterozigótos, 60-70% menos en homozigótos)

45. Daño directo del endotelio • Disminución de expresión de la Trombomodulina • Disminución de actividad de la PC • Aumento de actividad de FV • Aumento de la actividad plaquetaria Hiperhomocisteinemia y Trombosis

46. TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

47. KRASHomólogo humano del Oncogen Kirsten Rat Sarcoma Virus KRAS es un proto-oncogen, es una proteina de la cascada de transducción de señal del EGFR (RTK) Es una GTPase: el GTP se hidroliza a GDP inactivando el RAS, asegurando que la transducción de señales no es eterna. RTK proliferación diferenciación supervivencia modulación del metabolismo

48. Anticuerpos Monoclonales Anti-EGFR • Un descontrol en la cascada del EGFR puede ser la causa de procesos neoplásicos debido a un incremento en el número de receptores del EGF • Anticuerpos monoclonales anti-EGFR se unen al dominio extracelular del EGFR bloqueando la unión del ligando y la activación del receptor. • Cetuximab (Erbitux) – Merck • Panitumumab (Vectibix) – Amgen

49. Fármacos Anti-EGFR y mutaciones del KRAS Mutaciones del KRAS (RAS) conducen a una transducción de señales independientes del EGFR (RTK) Las terapias Anti- EGFR no son útiles en células tumorales que contienen KRAS mutado. • RAS Mutado se une al GTP pero no puede hidrolizarlo a GDP • RAS siempre está en su ESTADO ACTIVO • Descontrol de la transducción de señales • Estimulación permanente de la proliferación celular CANCER

50. Mutaciones del KRAS Mutationes en el gen KRAS ocurren con una frecuencia del 40-45% en pacientes con Cáncer Colorrectal metastásico >97.0% mutationes occurren en los codones 12 and 13