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流式细胞术在周期与凋亡 检测中的应用

流式细胞术在周期与凋亡 检测中的应用. 中山医学院药理学教研室 黄奕俊 2011.11. 本次培训讲座已录制视频，需要观看视频的各位老师和同学可带移动硬盘到科技楼北 810 房（原房号为北 806 房）拷贝视频 。 科研仪器管理中心. 流式细胞术的应用. 细胞 DNA 流式分析原理. 某些荧光染料（ PI 、 EB 、 HOs 、 DAPI 、 7-AAD 、 AO 等）与细胞内 DNA 碱基结合，在特定波长激光激发下发射出荧光，荧光强度与 DNA 含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的 DNA 含量。. Our bullets

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流式细胞术在周期与凋亡 检测中的应用

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Presentation Transcript

  1. 流式细胞术在周期与凋亡 检测中的应用 中山医学院药理学教研室 黄奕俊 2011.11

  2. 本次培训讲座已录制视频，需要观看视频的各位老师和同学可带移动硬盘到科技楼北810房（原房号为北806房）拷贝视频 。 科研仪器管理中心

  3. 流式细胞术的应用

  4. 细胞DNA流式分析原理 某些荧光染料（ PI、 EB、HOs、DAPI、 7-AAD、AO等）与细胞内DNA碱基结合，在特定波长激光激发下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。

  5. Our bullets —Dyes

  6. Preparation protocol 取对数生长期细胞，胰酶适度消化，800rpm离心 15 min。 PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。 用5mL注射器将细胞吸起，打入5mL 70%（预冷）乙醇中，4℃固定过夜（可长至4周）。 取0.2mL（100万细胞/mL），加入含RNaseA（50µg/mL）和PI（65µg/mL）的染色液0.4mL，室温避光染色60min。 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。

  7. 细胞周期： G0/G1(diploidy)→S→G2/M(tetraploidy) 各期细胞分布（比例）的变化提示细胞DNA含量和增值特性的变化。

  8. DNA Analysis 0 200 400 600 800 1000 4N 2N PI Fluorescence

  9. DNA index（D.I.）： (G0)G1s / (G0)G1n s = sample cells，n = control cells indicating the degree of DNA content abnormality

  10. DNA index 1.21 DNA Analysis Aneuploid peak 0 200 400 600 800 1000 PI Fluorescence

  11. 周期细分（cell cycle compartments）： G0 (G1Q)→G1T→G1A→G1B→S→G2/M

  12. Proliferative fraction： = S-phase fraction = SPF

  13. 相比目测确定水平门方式，利用去叠合程序（Deconvolution program）拟合DNA histogram是更为客观和准确的做法： MultiCycle for BC machines ModFit for BD machines

  14. C1

  15. C1+DrugA

  16. C1+DrugB

  17. C2+Ir+DrugB

  18. 使用去叠合程序进行拟合计算，理想的计数低限为200个细胞/通道，一般计数不少于5万个细胞。使用去叠合程序进行拟合计算，理想的计数低限为200个细胞/通道，一般计数不少于5万个细胞。

  19. 要注意的问题： 单独SPF数据不能完全正确反映增殖速率，应结合增值曲线或BrdU等数据联合分析。 为什么？ 最可靠的细胞增殖测定方法依次是： 1… 2… 3…SPF测定+ BrdU/EdU掺入测定

  20. 其它一些周期相关的DNA含量测定应用： • mutation detected by the widening of G0/G1 • Detecting mitotic cells

  21. 细胞凋亡的检测

  22. 凋亡（apoptosis）是指在形态学上发生封闭性内部降解的一种主动的细胞死亡过程，由于其发生发展的严格有序性、受调性和精巧性，故在功能学上又被称为程序性细胞死亡（programmed cell death），是机体细胞在一定条件下激活某种自杀机制，按照一定的调控方式进行的自我清除。

  23. 细胞凋亡提出的本质是要区别于细胞坏死，而且其概念最初是来自它们形态学上的差异，因此判断细胞死亡形式的首要标准是细胞的形态学（morphological）变化而非包括FCM指标在内的其它指标。细胞凋亡提出的本质是要区别于细胞坏死，而且其概念最初是来自它们形态学上的差异，因此判断细胞死亡形式的首要标准是细胞的形态学（morphological）变化而非包括FCM指标在内的其它指标。

  24. Apoptosis Decision Tree Apoptotic Sample Cells Cell Extracts Tissue Sections Flow* Flow* Microscopy ELISA IHC* Western Blot* / Immunoprecipitation Spectrofluorometry Gene Expression

  25. M bp 200 100

  26. What can FCM do in apoptosis detection？ Plasma Membrane: light scatter, Annexin-V, permeability Cytoplasm: Caspase activation, Redox status Cytoplasmic organelles: Mitochondrial membrane potential, lysosomes Nucleus: DNA content, DNA fragmentation, sensitivity to denaturation

  27. Apoptotic Sample Cells Microscopy Flow Fixed Unfixed Loss of membrane asymmetry: Annexin V* Cleaved markers:Active Caspase-3*, Cleaved PARP* Mitochondrialmembrane potential: MitoScreen (JC-1)* TUNEL / DNA fragmentation: APO-Direct / BRDU Caspase inhibitors: FAM-VAD-FMK

  28. 凋亡：DNA loss→subG1(apoptotic peak) 提示凋亡细胞的出现

  29. 要注意的问题： 以PI单染法进行凋亡细胞定量是最经济的方法，但其漏检和错检率都很高。漏检主要发生在S期和G2/M期的凋亡细胞，这些细胞即使有DNA含量降低，但其存有的DNA含量仍不低于二倍体细胞，因而不会出现subG1。错检的原因主要是细胞碎片和小颗粒也表现出低荧光。

  30. C3+DrugC

  31. 这是啥？

  32. 要注意的问题： 单细胞悬液的准备容易引起subG1假阳性和假阴性，容易引起细胞粘连。考虑降低胰酶的浓度，注意分散细胞时操作的柔和性，注意全程上清液的收集。

  33. AnnexinⅤ磷脂结合蛋白作为探针识别 细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（PS）

  34. ß-TG不同时间（0、6、12、18、24h)诱导HL-60细胞凋亡ß-TG不同时间（0、6、12、18、24h)诱导HL-60细胞凋亡

  35. Q：同样是PI染色，subG1（AP）和AV-PI检测有什么不同？为什么？Q：同样是PI染色，subG1（AP）和AV-PI检测有什么不同？为什么？

  36. 线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential，MTP）被认为是多数凋亡模型中胞内发生的早期重要事件

  37. Mitocapture、JC-1，聚集在MTP正常的线粒体膜上形成polymer，被488nm光激发后发出橙色荧光。当MTP丢失时染料分子从线粒体膜上解离下来，以monomer游离于胞浆，被488nm光激发后发出绿色荧光。

  38. A: PMN + medium alone (3 h) E: PMN +ONO-AE-248（3 h） B: PMN + medium alone (6 h) F: PMN +ONO-AE-248（6 h）

  39. C: PMN + medium alone (9 h) G: PMN +ONO-AE-248（9 h） D: PMN + medium alone (18 h) H: PMN +ONO-AE-248（18 h）

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