1 / 59

PREİMPLANTASYON GENETİK TANI

PREİMPLANTASYON GENETİK TANI. Hazırlayan: E. Sacide ÇAĞLAYAN. Genetik Bir Hastalık İçin Risk Taşıyan Çift Noninvazif Prenatal Tanı * Ultrasonografi,İTT, ÜTT, Maternal AFP Testi İnvazif Prenatal Tanı *CVS, Amniyosentez, Kordosentez, Preimplantasyon Genetik Test Sistemleri (PGT)

liv
Télécharger la présentation

PREİMPLANTASYON GENETİK TANI

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. PREİMPLANTASYON GENETİK TANI Hazırlayan: E. Sacide ÇAĞLAYAN

  2. Genetik Bir Hastalık İçin Risk Taşıyan Çift • Noninvazif Prenatal Tanı *Ultrasonografi,İTT, ÜTT, Maternal AFP Testi • İnvazif Prenatal Tanı *CVS, Amniyosentez, Kordosentez, • Preimplantasyon Genetik Test Sistemleri (PGT) *Prenatal genetik tanı (PGD), Prenatal genetik tarama (PGS)

  3. PGT, genetik açıdan hastalıklı çocuk sahibi olma riski çokyüksek aileler için konvansiyonel prenatal tanı yöntemlerinden daha avantajlı bir uygulamadır. • Gebelik öncesinde, yardımcı üreme teknikleri ile elde edilen embriyoların genetik analizinin yapılması esasına dayanır.

  4. PGT • PGD: Başvuran çift etkilenmiştir (kendisinde ve ailesinde genetik hastalık bulunur) *PCR, FISH,CGH • PGS: Başvuran çift etkilenmemiştir *FISH

  5. Tarihçe • 1968 yılında, Edwards ve Gardner, ilk ebriyo biyopsisini tavşanlar üzerinde denemiştir. • İnsanlarda, ilk PGD denemesi 80’li yılların ortalarında, prenatal tanı yöntemlerine alternatif olarak geliştirilmiştir. • Başlangıçta, PGD, X’e bağlı kalıtımı önlemek için cinsiyet belirlenmesi ile ilgilenmiştir. • 1989’da Handyside ve ekibinin uyguladığı, X’e bağlı kalıtılan bir hastalık için ilk PGD denemesi ile sağlıklı bir doğum gerçekleştirilmiştir.

  6. 2006 yılına kadar,15.000’den fazla PGD uygulaması rapor edilmiştir. • Günümüzde PGD ile, bir çok genetik mutasyon belirlenebilmektedir. • PGD, günümüzde sağlam bir şekilde uygulanabilmektedir ancak PGS hala yeni, yavaş yavaş gelişen ve tartışılan bir yöntemdir.

  7. PGD’nin Önemi • Genetik bir hastalığı kalıtma riski çok yüksek olan çiftlere uygulanır. • Sadece etkilenmemiş ve sağlıklı embriyoların uterusa transferi yapıldığından erken veya geç dönemde yaşanan abortus veya gebeliğin sonlandırılması gibi travmatik durumlar önlenmektedir.

  8. PGD 3 temel hastalık grubu için önerilmektedir. 1) Cinsiyete bağlı kalıtılan hastalıklar 2) Tek gen hastalıkları 3) Kromozomal Düzensizlikler • Günümüzde multifaktöriyel hastalıklara ve nonmendeliyen hastalıklara yönelik PGD uygulamaları de yapılabilmektedir

  9. Cinsiyete Bağlı Kalıtılan Hastalıklar • X’e bağlı kalıtılan hastalıkların bir sonraki nesle aktarılmasından taşıyıcı bir anne sorumludur. • Taşıyıcı anne, anormal X kromozomunu erkek çocuğuna aktardığında hastalık ortaya çıkar, çünkü babadaki normal X’in geçişi olmaz. • Etkilenmiş babanın erkek çocuklarının tamamı normal olurken, kız çocukları taşıyıcı olur. • Hemofili, frajil X ve birçok musküler distrofi (resesif) • Rett sendromu ve psödohiperparatiroidizm (dominant)

  10. Tek Gen Hastalıkları • Bu tip hastalıkların tanımlanmasında, PCR temelli moleküler teknikler uygulanmaktadır. • En önemli sorunlardan biri çok sayıda mutasyon içeren hastalıkların analizinde yaşanmaktadır. • Birçok nadir mutasyon rutin olarak çalışılamamkta ve klinik belirtisi olmayan bir çiftin taşıyıcı olma riski bulunmaktadır • Kistik Fibroz (CF), Tay-Sachs, Orak Hücre Anemisi ve Huntington • BRCA-1 (spesifik bir hastalık nedeni değil ancak bir grup hastalık için risk artışına yol açan mutasyonlar)

  11. PGT – Tek gen hastalıları OTOZOMAL RESESSİF Kistik fibrozsis (various mutations) Tay Sachs hastalığı -talassaemi Orak hüreli anemi Rh grubu tayini Spinal müsküler atrofi Adrenogenital sendrom Konjential adrenal hiperplazi Epidermolizis bülloza Gaucher hastalığı Fanconi anemisi HLA uyumu Üçlü tekrar hastalıkları Frajile X Miyotonik distrofi Huntington hastalığı OTOZOMAL DOMINANT Marfan sendromu Charcot-Marie Tooth hastalığı (type 1A) Crouzons sendromu NF2 Osteogenesis impeerfekta I and IV Stickler sendromu Tuberoz skleroz Familyal adenomatöz polypozis koli Li Fraumeni sendromu Retinoblastoma X’e bağlı Lesch Nyhan sendromu Duchenne kas distrofisi Charcot-Marie Tooth hastalığı Retinitis pigmentoza Ornitin Transkarbamilaz Hemofili Agammaglobulinemi Alport sendromu Hunter sendromu MPSII Oro-facial-digital sendrom tip I

  12. Kromozomal Düzensizlikler • Translokasyon, delesyon, insersiyon gibi yapısal düzensizlikler Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH) tekniği ile belirli bir lokusa spesifik, telomerik problar kullanılarak belirlenmektedir • Bazı çiftler, PGD uygulanmadan, kendiliğinden oluşan bir gebelikle çocuk sahibi olamamaktadır, çünkü önceki konsepsiyonlarda dengesiz kromozomal düzensizlik spontan düşüklere yol açmaktadır.

  13. PGS ve Endikasyonları • Yüksek risk taşıyan hastalarda anöploidi taramaları amacıyla yapılır. • PGS için gerekli endikasyonlar: • İleri maternal yaş • Tekrarlayan gebelik kaybı öyküsü • Tekrarlayan IVF başarısızlığı • İnfertilitede erkeğe bağlı faktörler

  14. PGS • Embriyoda anöploidi riski, anne 35-39 yaş arasında ise %20’den daha yüksekken, 40 yaş ve üzerinde yaklaşık %40 civarındadır. • Bu tip olguların birçoğu, gebelikten kuşkulanmadan önce kaybedildiği için fark edilememektedir • PGS uygulaması ile sağlıklı gebelik oluşma ihtimali artarken, düşük veya etkilenmiş embriyo oluşumu riski düşmektedir.

  15. PGD ve Cinsiyet Belirlenmesi • Kültürel, etnik, sosyal ve psikolojik nedenlerden dolayı, bazı durumlarda arzu edilen cinsiyette çocuk sahibi olmak için PGD’den yardım almayı taleb eden çiftler olabilmektedir. • Bu tip uygulamalara yaklaşım toplumdan topluma değişebilmekle birlikte hala yoğun olarak tartışılmaktadır.

  16. PGT’nin AŞAMALARI 1)IVF 2) TEK HÜCRE BİYOPSİSİ 3) GENETİK TESTLER 4) EMBRİYO TRANSFERİ

  17. IVF • Ovaryan Stimulasyon • Foliküler Aspirasyon • Maturasyon İçin Bekleme • İntrasitoplazmik Sperm İnjeksiyonu (ICSI) • Fertilizasyon Sonrası Embriyonik Gelişim İçin Kültür Süreci

  18. TEK HÜCRE BİYOPSİSİ • Polar body biyopsisi • Yarıklanma aşamasında embriyo biyopsisi • Blastosit biyopsisi

  19. İlk gün İnsan OositiHazırlanmış Sperm

  20. Intrasitoplazmik Sperm Injeksiyonu(ICSI)

  21. 2. gün 2 hücreli embriyo 4 hücreli embriyo

  22. 3. Gün • 8 hücreli embriyo (72 saat) • Yarıklanma aşamasında biyopsi (blastomerler)

  23. 5/6. günler • Blastosist • Biyopsi?

  24. Blastomer biyopsisi (3.gün) Kutup cismi biyopsisi

  25. PGD’DE KULLANILAN GENETİK TESTLER • PCR • FISH • CGH

  26. PCR (DNA Amplifikasyonu) • Genellikle, dominant veya resesif hastalıkları kapsayan tek gen defektlerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. • DNA molekülü, nükleotid bazlara ve primere tutunmayan DNA polimeraz enzimi içeren bir solusyonla muamele edilir. • Yüksek ısıda DNA iplikleri arasındaki bağlar yıkılır. Isı düşürüldüğünde, DNA polimeraz serbest nükleotid bazları primere bağlayarak hızlı bir şekilde yeni iplikler sentezler. • İki primer arasındaki boşluğun tamamlanması ile yeni bir iplik sentezlenmiş olur. • Bu işlemin defalarca tekrarlanması ile, birkaç saat içinde DNA’nın küçük bir kısmının milyarlarca kopyası oluşturulmaktadır.

  27. Bu yöntem bir çok PGT protokolünde yer almaktadır. • Burada, yeterli miktarda ve yüksek kalitede saf DNA molekülü elde etmek gerekir ve bazı durumlarda polar body ve blastomer gibi tek bir hücrede bunu gerçekleştirebilme hususunda güçlükler yaşanabilir • Allelik dropout ve laboratuvar kontaminasyonu da yaşanabilecek önemli komplikasyonlardır. • PGD’de tek bir hücre amplifiye edilmelidir. • ICSI işleminde maternal ve paternal kaynaklı kontaminasyonun mümkün olduğunca önlenmesi gerekmektedir.

  28. PCR’dan kaynaklanan hatalar, etkilenmiş bir embriyonun transferi veya normal bir embriyonun fark edilememesine neden olabilir (Ör: allelik dropout). • Otozomal dominant hastalıklarda etkilenmiş bir embriyonun transfer riski %11, resesif hastalıklarda ise %2’dir.

  29. PGD’de PCR Uygulamaları: • Otozomal hastalıklarda tek gen defektlerinin belirlenmesi • Erkek infertilitesinde tek gen defektlerinin belirlenmesinde • X’e bağlı hastalıklarda cinsiyet tayininde

  30. FISH • Özellikle, X’e bağlı kalıtılan hastalıklarda cinsiyet tayini, kromozomal düzensizlikler ve anöploidi taramalarında kullanılmaktadır. • Anöploidi taramalarında sağladığı kolaylık nedeniyle PGS’de daha yaygın kullanılır. • Bu işelmde, incelenecek kromozomla eşleşmek üzere prob (her prob farklı boya ile işaretli) adı verilen küçük DNA molekülleri kullanılmaktadır. • Floresans mikroskobu ile yapılan inceleme sonucu her kromozom renklere göre ayırdedilir. • Analiz edilebilecek kromozomlar 13,16,18, 21, (22),X ve Y’dir.

  31. FISH Yöntemi►Denatürasyon . 730 C 5 dakika ►Hibridizasyon . 370 C 3 saat ►Hibridizasyon sonrası yıkama . 2 dakika 0.4XSSC ►Analiz

  32. Hangi kromozomlar analiz ediliyor? • X, Y, 13, 18, 21 • 13, 16, 18, 21, 22

  33. 18 16 18 21 13 22 13 21 16 22 NORMAL FISH

  34. Trizomi 13 (Blastomer nükleusu)

  35. CGH • Embriyo nükleusu floresans bir boya ile işaretlenirken, bir kontrol hücresi farklı bir boya (genellikle yeşil) ile işaretlenir. • İki hücrenin daha sonra kontrol metafaz plağında kohibridizasyonu gerçekleşir. • İki renk yoğunluğu arasındaki fark karşılaştırılır. • Kırmızı renk fazla ise embriyo nükleusu ekstra kromozom içermekte, yeşil yoğunluğu fazla ise embriyoda eksik kromozom bulunmaktadır. • Bu teknik yaklaşık 72 saati almaktadır.

  36. PGD UYGULAMALARINDA DİKKAT EDİLECEK HUSUSLAR • İnfertilite problemi olmayan hastalar IVF için yönlendirilir ve IVF tedavisi ile ilişkili riskler hakkında bilgilendirilir. • Hastalara, PGD için yapılacak IVF işlemi hakkında genetik danışma mutlaka verilmelidir, ilgili kalıtım paternleri ve hastalığın etkilenmiş çocuk ve aile üzerindeki olası etkileri detaylı olarak anlatılmalıdır. • PGD veya PGS uygulaması yapılacak olsa bile hastalara prenatal tanı (amniyosentez, CVS, kordosentez) hakkında mutlaka bilgi verilmelidir. • Donör gametlerinin kullanılması gibi alternatif tedavi stratejileri de tartışılmalıdır. • Başarılı bir IVF ve PGD gerçekleşse bile transferden sonra gebelik, zamanında veya erken doğum garanti edilmez.

  37. Hücrenin zedelenmeden veya ciddi bir hasara uğramadan alınması işlemi teknik olarak oldukça zordur, beceri ve deneyim gerektirmektedir. Embriyonun kazaya bağlı olarak yaklaşık %0.1 oranaında hasar görme riski bulunmaktadır • Yeni bir hastalığa yönelik tanısal metodoloji zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir. • Tek bir hücrenin analiz ediliyor olması bazı sınırlamaları da beraberinde getirir. Eğer embriyoda farklı hücre hatları bir arada bulunuyorsa mozaisizm belirlenemez. • Bu sebeple, özellikle amniyosentez gibi prenatal tanı testleri ile sonuç doğrulanmalıdır. • Bazı durumlarda, çok sayıda yumurta hücresi veya embriyo anormal olarak belirlenebilir. Bu sebeple az sayıda embriyo transfer edilebilir veya embriyo transferi mümkün olmaz.

  38. Anöploidi taramalarında, PGD ile tüm kromozomlar veya tüm anomaliler tanımlanamamaktadır. Çünkü bir test protokolünde, bir uygulamada sınırlı sayıda kromozom analiz edilebilir. • Günümüzde, bir hücre biyopsisinde tek tip genetik araştırma uygulanabilmektedir. Çok sayıda genetik araştırmanın aynı anda yapılması mümkün değildir. • Kistik fibroz gibi çok sayıda mutasyonun görüldüğü tek gen hastalıklarında PGD, ikna edici olmayabilir. Bu durumda çiftlere yeni probların oluşturulmasını gerektiren spesifik testler uygulanmalıdır . Yeni probların üretilme süreci birkaç haftayı almaktadır.

  39. Çözüm: Prenatal Tanı PGT’de olası yanlış tanı nedenleri • PCR • Allel dropout • Kontaminasyon • sperm/kumulus/DNA/hücreler • Mozaiklik • FISH • Kontaminasyon • Kumulus hücreleri • Mozaiklik

  40. PGS UYGULAMALARINDA DİKKAT EDİLECEK HUSUSLAR “ PGS günümüzde hala tartışılan bir yöntemdir. Başlangıçta maternal yaşa bağlı risk artışında embriyoda anöploidiyi önlemek için umut verici bir gelişme olarak kabul edilse de, son çalışmalar belirli populasyonlarda başarının sınırlı olduğunu göstermiştir.

  41. Tekniksel Sınırlılıklar: Günümüzde, FISH yöntemi ile 9-11 kromozom analizi mümkündür. CGH ve FISH ile yapılan çalışmalarda, embriyodaki anöploidi %25 oranında belirlenir ve normal olarak tanımlanır, anormal kromozomlar belirlenmez. Analiz edilen hücrelerin yaklaşık %10’una sonuç verilemez veya tereddüt yaşanır.

  42. Tek Hücre Analizinin Sınırlılıkları: Nondisjunction mayoz esnasında oluşmuşsa, embriyoya ait tüm hücrelerde anöploidi görülür. Ancak, mitoz esnasında oluşmuşsa, embriyoda iki veya daha fazla hücre hattı bulunabilir. Tek hücre biyopsisi, embriyodaki mozaisizmin belirlenmesinde yeterli değildir.

  43. Self-Correction: Mozaik bir embriyonun, anormal hücrelerin proliferasyonunu durdurabilme özelliği sonucu, anöploidi tanımlanmış çoğu embriyonun hayatta kalarak, yeniden analiz edildiğinde normal olarak belirlendiğini gösteren kanıtlar mevcuttur.

More Related