SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE

1. SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE Šíření světla prostorem V prostoru se světlo šíří podle tzv. Huygensova principu, který říká, že každý bod se stává sám zdrojem záření. V geometrickém popisu se zavádí pojem světelný paprsek. V opticky homogenním prostředí se světelné paprsky šíří přímočaře a nezávisle na sobě. V nehomogenním prostředí může dojít k odrazu, lomu nebo ohybu světla, případně k jeho absorbci. Interference světla K interferenci dochází pokud je splněna podmínka koherence vlnění. Koherentní jsou taková vlnění, která mají stejnou frekvenci a jejichž fázový rozdíl je v daném bode neměnný. Interferencí dochází v různých bodech k zeslabení nebo zesílení intenzity světla. Při interferenci vln jejichž fáze je vzájemně posunuta o sudé násobky λ/2 vznikají interferenční maxima a při interferenci vln jejichž fáze je vzájemně posunuta o liché násobky λ/2 vznikají interferenční minima

2. Ohyb (difrakce) K ohybu dochází na překážkách, jejichž velikost je řádově srovnatelná s vlnovou délkou světla (vlas, velmi úzká štěrbina, hrot jehly, optická mřížka). Průchodem překážkou dochází k ohybu světla a za překážkou k interferenci ohnutých paprsků. Vzniká tak ohybový obrazec v podobě interferenčních maxim a minim, jejichž tvar závisí na tvaru překážky. Ohyb vlnění lze vysvětlit pomocí Huygensova principu.

3. SVĚTELNÝ MIKROSKOP Historie 1590-1610 - Vyrobeny první přístroje, které lze považovat za použitelný mikroskop (Hans a Zaccharis Janssenové z Middleburgu v Hollandsku). Přelom 17. a 18. století - Antoni van Leeuwehoek brousil čočky vynikající kvality. Vyrobil asi 505 mikroskopů, které zvětšovaly až 270x. 1847 – Zahájení výroby mikroskopů firmou Carl Zeiss v Jeně. 1911 – Fluorescenční mikroskop s UV excitací (C. Reichert). 1932 – F. Zernick objevil fázový kontrast (Nobelova cena roku 1953). 1955 – Diferenciální interferenční kontrast (Nomarski). 1968 – Rastrovací tandemový konfokální mikroskop (TSCM). 1978 – Laserový konfokální rastrovací mikroskop

4. Stavba světelného mikroskopu

5. Fyzikální podstata vzniku obrazu v optickém mikroskopu Vysvětlení podal Ernst Abbe (1873) a doložil jej poměrně složitou teorií, kterou zde pomineme. Základní myšlenka se opět opírá o Huygensův principu – každý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln. Zaostřená rovina preparátu je takovým objektem. Podle optických vlastností jednotlivých bodů objektu se dopadající světlo v každém z bodů transformuje (ohýbá se, láme, mění se jeho amplituda, fáze) a vznikají sekundární vlny. Ty spolu interferují, jako po průchodu světla štěrbinou nebo optickou mřížkou. Výsledné vlnění, které obsahuje informaci o vzhledu objektu vstupuje do objektivu. V jednotlivých bodech zadní ohniskové roviny objektivu se setkávají sekundární vlny, které opustily rovinu předmětu rovnoběžně. Dochází k jejich interferenci a v souladu s Huygensovým principem se stávají zdrojem nových vln, které v obrazové rovině mikroskopu skládají zvětšený a převrácený obraz.

6. Objekty lze podle optických vlastností rozdělit do dvou skupin: • Amplitudové: • Zbarvené objekty, které absorbují světlo. • Snižují amplitudu vlny, což se projeví na jeho intenzitě. • Pokud objekty absorbují všechny části spektra rovnoměrně, • jeví se jako tmavé, absorbují-li je různě, jeví se jako barevné. • Rozdíly v absorbanci různých jejich částí se stávají zdrojem kontrastu. 2. Fázové: Nebarevné objekty, které se liší od okolí indexem lomu a tloušťkou. To způsobí změnu fáze procházejícího světelného vlnění, kterou však lidské oko nezaznamená. Kontrast fázových objektů, lze zvýšit pomocí cytologických a histologických barviv nebo pomocí optických metod, které převádějí rozdíly v indexech lomu na jasový kontrast (zástin, fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast, Hoffmanův modulační kontrast).

7. Rozlišovací schopnost mikroskopu Rozlišovací schopností rozumíme vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body (a). Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření. U světla se to tedy rovná zhruba 250nm. Rozlišovací schopnost u mikroskopu je dále omezena množstvím světelných paprsků, které mohou vstoupit do objektivu (světelnost objektivu) a můžeme ji vypočítat podle vzorce. λ vlnová délka světla n index lomu prostředí před objektivem α polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu a=0,61.λ/n.sinα

8. n a α jsou pro daný objektiv konstanty a celý jmenovatel ve vzorci (n.sinα) se označuje jako numerická apertura objektivu (NA). Je to jedna ze základních charakteristik objektivu a její hodnota je na objektivu uvedena.

9. Numerická apertura nejkvalitnějších imerzních objektivů je 1,3-1,4. Pro nejkratší vlnové délky (400nm) se pak rozlišovací schopnost těchto mikroskopů blíží hodnotě 0,17μm. Ze vzorce pro rozlišovací schopnost plyne, že rozlišovací schopnost mikroskopu lze zvýšit 1. snížením λ – použití modrého světla (modrý filtr), proudu elektronů (elektronová mikroskopie) 2. zvyšováním n – použití imerzního oleje Vliv imerzního oleje na rozlišovací schopnost mikroskopu ukazuje obrázek. Přidáním imerzního oleje, který má vyšší index lomu než vzduch, mezi preparát a objektiv se předchází ztrátám světla, které se láme na rozhraní preparát/prostředí. Do objektivu pak dopadne větší množství paprsků. Na rozlišovací schopnost mikroskopu má také vliv NA kondenzoru. Nejlepší rozlišovací schopnosti bychom měli dosáhnout, použijeme-li kondenzor jehož NA je rovna asi 1,5 násobku NA objektivu.