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全长单链 PCR 产物整合到枯草芽孢杆菌体内

全长单链 PCR 产物整合到枯草芽孢杆菌体内. 齐鑫. 枯草芽孢杆菌. 芽孢杆菌属的一种，不致病 无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢 0.6 ～ 0.9×1.0 ～ 1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭（ b ú ） 可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚 主要用于工业生产，有的菌株是 α- 淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌. 枯草芽孢杆菌生长条件. 最适温度： 32 ℃ 最适 pH 值： 7.0 最适转速： 120r/min

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全长单链 PCR 产物整合到枯草芽孢杆菌体内

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  1. 全长单链PCR产物整合到枯草芽孢杆菌体内 齐鑫

  2. 枯草芽孢杆菌 • 芽孢杆菌属的一种，不致病 • 无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大 • 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭（b ú ） • 可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚 • 主要用于工业生产，有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌

  3. 枯草芽孢杆菌生长条件 • 最适温度：32℃ • 最适pH值：7.0 • 最适转速：120r/min • 芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min

  4. 枯草芽孢杆菌具有同源重组机制，以前根据这一点研究过：枯草芽孢杆菌具有同源重组机制，以前根据这一点研究过： • gene disruption/replacement • Recombinational cloning • direct repeated (DR) sequences mediated in-frame deletion • marker rescue system • Multimeric plasmid-based transformation • recombinational capture of PCR products

  5. 一些研究发现利用引入外源的重组系统比如Cre system 和λ Red proteins system，结合电转化，可以有效的进行枯草芽孢杆菌体内的重组。 • Cre system：P1噬菌体感染大肠杆菌，在溶源状态时是单拷贝质粒，在裂解状态时是作为线状双链DNA包进噬菌体头部中。P1编码的重组酶Cre催化两个loxP位点间的重组，被广泛应用。

  6. 2010年，研究发现， λ重组系统中，利用的是dsDNA降解为ssDNA，然后才进行重组。 • 这一点和枯草芽孢杆菌一致，外源dsDNA到细胞表面时候会降解成为ssDNA，早在1991年就发现了。 • 于是就有了一种新的方法 • 利用单链DNA是否比双链DNA更加有效？

  7. 可行性验证

  8. 1 • 三对引物的PCR反应

  9. 2 • 联合PCR，有一个问题：2004年有人证明，用最外面的引物再次扩增是有困难的。

  10. 3 • 嵌套PCR • 前后截去500bp的长度

  11. 4 • 不对称PCR：引物比为30pmol和0.5pmol。

  12. 转化 1：线性化的dsDNA 2：先导链ssDNA 3：后随链ssDNA 4：正对照：pMA5 分别以这四种作为转化的底物，电转到B.subtilis DL3p， B.subtilis DL3p是B.subtilis 168的一种蛋白酶缺陷型菌株，即可以表达一些特定的蛋白。

  13. 淀粉板验证转化是否成功 • 左边菌落为正对照，右边菌落为用kana基因代替amyE基因的菌株。

  14. PCR验证转化是否成功 • 1：重组了kana基因 • 的菌株为模板 • 2：负对照 • 3：转化了pMA5质 • 粒的菌株为模板

  15. 计算转化效率方法 • 孵育完涂板时，稀释10000倍涂在无kana的LB板上，计算菌落数量。（能成活的细胞数目） • 正常的实验组，原浓度涂在有kana的LB板上。（进行正常的筛选）得到CFU • 两者数据相除，再除以DNA的质量（ug），得到转化效率，单位为CFU/ug DNA per viable cell

  16. 转化效率对比 1：线性化的dsDNA 2：先导链ssDNA 3：后随链ssDNA 4.5.6为1.2.3分别在 5’端两个连续硫磷 酰化的结果（起到 保护作用）

  17. 一些问题 • 1.在之前研究中大肠杆菌ssDNA的转化效率不如dsDNA。 • 造成的可能原因是ssDNA的二级结构不同。 • 2.5’端的基团可以保护5’端不受降解，明显可以提高转化效率。

  18. 更多的研究 • 在枯草芽孢杆菌中引入解脂耶罗维亚酵母中的Lip2基因。可以合成脂肪分解酵素。

  19. 过富培养基上培养：2% (w/v) yeast extract, 2.5% (w/v) tryptone, 3% (w/v) K2HPO4)containing 1% (w/v) starch • 测定酶的活性使用p-nitrophenyl方法，进行分光光度法测量。

  20. B.subtilis DL3p ： • 0.02±0.01 U/mg total protein • 转入Lip2基因的B.subtilis DL3p ： • 0.91±0.05 U/mg total protein.

  21. 总结 • 后随链的ssDNA转化入枯草芽孢杆菌体内的效率很高。 • 如果在5’端加上硫磷酰化的保护基团，会更加增加转化效率。 • 这个实验不仅表现了枯草芽孢杆菌研究的一个可行性，还说明一些其他菌株也可以作为实验工具的潜力。

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