1 / 157

transzkriptomika

degradáció. degradáció. Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában. DNS. Gén. transzkripció, RNS szerkesztés. RNS. transzkriptomika. transzláció, poszttranszlációs módosítás. proteomika. fehérje. biokémiai aktivitás. metabolikus útvonalak.

lowri
Télécharger la présentation

transzkriptomika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. degradáció degradáció Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában DNS Gén transzkripció, RNS szerkesztés RNS transzkriptomika transzláció, poszttranszlációs módosítás proteomika fehérje biokémiai aktivitás metabolikus útvonalak metabolomika

  2. A BIOLÓGIAI INFORMÁCIÓ HORDOZÓ MEGFEJTÉSE GENOMIKA A teljes genetikai állomány szekvenciájának meghatározása, A szekvenciákon elhelyezkedő funkcionális régiók számítógépes jóslása: annotálás

  3. Funkcionális genomika RNS szinten TRANSZKIPTOMIKA

  4. Egy DNS chip kísérlet folyamatábrája

  5. A chipek kiértékelése, eredménye

  6. Funkcionális genomika fehérje szinten PROTEOMIKA

  7. Proteomika EgyTipikus protokol Izoelektromos fókuszálás SDS PAGE Minta elő Protein azonosítás • tömegspektrometria • Láthatóvá tétel • Protein pötty kivágás • Kép analízis

  8. Proteomika: az elválasztástól az azonosításig

  9. Oligonukleotid szintézis Mintegy 50 éves múlt 5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát Szilárd fázisú szintézis: hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható mind a két módszerrel

  10. Oligonukleotid szintézis: monomerek

  11. B B 1 1 Ac O O O 2 O O H H O O O O hordozó hordozó Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer B 1 B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O di-MeO Tr O O O I / H O B 2 2 1 di-MeO Tr O O B O 1 O O O P O O N C O O P O O N C O O hordozó hordozó

  12. Néhány automata szintetizátor

  13. OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I. - Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról -liofilezés, sómentesítés

  14. e(µmol * cm/cm3) bázis dA 15.4 dG 11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan e = 10 (µmol * cm)/cm3 -kvantitálás OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II. -méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges) Ioncserés kromatográfia Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül

  15. OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - antiszensz oligonukleotidok, génterápia - gén darabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

  16. Linkerek rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálvaolyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egytetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét:Restrikciós hely bevitelére alkalmas BamHI...........CGGATCCGEcoRI...........GGAATTCCPstI............GCTGCAGC ADAPTEREK szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisekkülönböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel. Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja. Hosszú adapterek: két ragadós vég között egy harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye Rövid adapterek: egyik vég ragadós, a másik tompa. EcoRI pl. BamHI(ApaI) SacI EcoRI – SmaI...5'AATTCCCGGG 3‘3’GGGCCC 5’ 5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3'3' GCCCGGGACAATC 5' SmaI

  17. Primerek szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára. Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek. Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált speciális szekvenciájú oligonukleotidok.

  18. Polimeráz láncreakció I. Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

  19. Polimeráz láncreakció II.

  20. A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI - belső PCR, specificitás növelése belső primerek használatával egy elsődleges PCR terméken - egy specifikus primert használó PCR + primer adapter limitált információ esetén - LM PCR, ligálás közvetített PCR, kromoszóma metiláltsági térképezésére - inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására - “farkazott PCR” ld. cDNS izolálás - RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. cDNS - kvantitatív PCR, mRNS mennyiségének becslésére

  21. A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI klónozás, megfelelő DNS szakaszokkinyerése, esetenkéntdegeneráltprimerekkel  DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase mutagenezis szálspecifikuspróbák előállítása diagnosztika fertőzésekkimutatására mutánsallélekkimutása

  22. 1. PCR 2. PCR BELSŐ (NESTED) PCR 2 primer párt használunk nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése  költségesebb

  23. A A hasítás 'A' restrikciós enzimmel A A önligálás A PCR 'A' INVERZ PCR A géneket környező régiók kiamplifikálkására Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert  primer pár tervezhető

  24. antiszensz primer mRNS reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn2+ jelenlétében cDNS szensz primer PCR 1000 750 500 250 bp RT+ RT- gK REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR (RT-PCR) Gének szerveződésénekvizsgálatára

  25. plató termék lineráris szakasz exponenciális rész ciklus szám REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR Az RNS preparátumnakDNS mentesnek kell lennie Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása

  26. Real-time PCR T 95°C 72°C 50°C Denaturálás Hibiridizáció DNA szintézis Denaturálás : SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI

  27. gDNA: 280ng 28ng 2.8ng 0.28ng 0.028ng Real-time PCR reakció analízise Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel.

  28. A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás

  29. O1 O1 O2 CO2 BamHI XhoI A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak 1-2 hiba 1 kb hosszon Mn2+ vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció irányított: Mf BamHI XhoI Mr O1-Mr 1st PCR-s Mf –O2 BamHI XhoI 2nd PCR O1 – O2 digest with XhoI andBamHI ligate into XhoI – BamHI digested vector

  30. A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I. - FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket  speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

  31. 5' A 3' A 5' 3' C PCR nincs termék egészséges beteg 5' C 3' A 5' 3' C PCR nincs termék beteg egészséges normális A 5' 3' C mutáns gén A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA

  32. Ligálás és a PCR kombinálása

  33. GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK 1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből 1. fragment 2. fragment 1+2. fragment 3. fragment 1+2. fragment 1+2+3. fragment hátrány: drága, mind a két szálat meg kellszintetizálni

  34. 2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel 3’ 5’ 5’ 3’ Klenow, dNTP 5’ 3’ 3’ 5’ Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik. 2.a. Hajtű módszer 5’ 3’ Klenow, dNTP emésztés restrikciós endonuklázokkal ligálás

  35. 2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus(gap repair) kihasználásával Híd ligálás 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ átfedő szintetikus oligonukleotidok hasított vektor hibridizálás, enzimatikus feltöltés hasított vektor 5’ 3’ 3’ 5’ polimerizáció Klenow, dNTP ligálás közvetlen transzformálás transzformálás

  36. Cél molekula: fehérje mRNS DNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú a leolvasással ellentétes a leolvasással megegyezõ mRNS RNS DNS duplex triplex fehérjék sejtmag sejtmembrán köcsönhatás fehérje-DNS RNS-DNS hibrid/ RNáz H Hoogsteen féle triplex Gátlás transzkripciós szabályozás transzláció transzkripció Kromoszómális DNS citolplazma oligonukleotid Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal

  37. Triplex képződésének kölcsönhatásai homopurin homopirimidin szekvenciáknál

  38. Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái a mRNS-en • exon-intron határhoz, slicing gátlás • Az 5’ sapka régióhoz • Transzlációs iniciációs régióhoz • Génen belüli régióhoz • Kapcsolódó oligonukleotidok Elsődleges hatásmechanizmus: Az endogén RNázH leemészti a DNS:RNS hibrid RNS szálát

  39. B B 1 1 Ac O O O 2 O O H H O O O O hordozó hordozó Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer B 1 B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O di-MeO Tr O O O I / CS2 B 2 1 di-MeO Tr O O B O 1 O O O P O O N C S O P O O N C O O hordozó hordozó

  40. PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA) Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus Stabil PNA T10-Lys TTTTTTTTTT-Lys PNA SV40-Lys ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól

  41. MUTAGENEZIS - in vivo gének elrontására,vagy módosítására • Random mutagenezis • találomra létrehozott mutációk • mutagén anyagok: UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás • PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb • mutagén törzsek • transzpozon mutagenezis Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

  42. Gének irányított szétroncsolása: interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 Ar1 oriT ori Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

  43. Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia Ar1 ori oriT vad típus mutáns poláris hatás ?

  44. QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

  45. FEHÉRJE TERMELTETÉS VAN GÉNÜNK: Legyen az prokarióta vagy eukarióta természetes vagy szintetikus vad típusú vagy mutáns

  46. FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK PROKARIÓTÁK E.coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E.coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK • emlős sejtvonalak • minden fajta fehérje termeltethető bennük • tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetőségek, • stabil expressziós rendszerek • hosszú, fáradságos optimalizálást igényel • élesztő • gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, • sok ismeretanyag • viszonylag könnyű kezelhetőség • poszttranszlációs modifikációk lehetősége

  47. Escherichia coli • ELŐNYÖK  • óriási mennyiségű ismeretanyag • könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium • nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása • ismert szelekciós rendszerek • legtöbb expressziós rendszer • HÁTRÁNYOK  • általában nem szekretál • a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidakkialakulása gátolt • az eukarióta poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak • nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding

  48. STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE KONSTITUTÍV PROMÓTER INDUKÁLT TERMELTETÉS • a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik • nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése • nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt • a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig • valamilyen indukcióval derepresszió • további növesztés • fehérje visszanyerése • legáltalánosabban használt stratégia • toxicitás sok esetben megoldható

  49. TSZE PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI SZF GS  Pr -35 -10 SD kódoló szekvencia TT STOP kodon UAAU UGA UAG -10 -35 TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

More Related