设计短肽配基

设计短肽配基 分离提纯质粒DNA新方法报告人屠依龙报告时间 2012.10.12

目录 1.研究背景 2.国内外研究进展 3.研究意义 4.研究目标及拟解决问题 5.研究方法技术手段 6.参考文献

研究背景 基因疗法，DNA药物的广泛应用病毒的不安全性质粒的优势：使用安全易于转染生产简易

质粒合成与分离

色谱法分离提纯

研究现状 短肽配基仿生设计分子模拟现状

研究现状——多肽配基设计 • 原理：乳糖操纵子DNA域（lacO）→乳糖阻遏蛋白（LacI） • LacI为DNA结合蛋白，结合域包括螺旋Ⅰ（6-12），转角，螺旋Ⅱ（17-25），螺旋Ⅲ（32-45），螺旋Ⅳ（50-58）。其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ形成HTH结构。 • LacI几乎不与RNA反应，固定化后依然具有生物活性

分子模拟现状 • LacI通过与LacO特异性结合控制着乳糖代谢，与操纵子结合部位可分为O1、O2、O3三个部分。这三个部分功能不同，以O1为主，O2、O3为辅。最为重要的是中心的17对碱基对，以中间的G:C为中心形成伪倒序结构。 • LacI-LacO结合部位的磁核共振建模已经成熟，有现成的对接模型 • 有研究者采用对比方法，比较了LacI头分别与O1、O2、O3的反应，发现与O1、O2都表现出良好的亲和性，而与O3形成额外的复合物，这可能与非特异性吸附有关。 • 有研究表明其中C端残基Arg50-Gly58形成枢纽区域。

研究的目的及意义 研究意义： • 目前依然处于多肽配基研究的早期阶段，实验中常常套用蛋白分离的技术方法。虽然蛋白短肽配基已有所发展，但是质粒由于分子量大，空间位阻较大，作用更为复杂； • 多肽配基的合成成本高昂，肽链长度直接决定了合成成本，短肽一般6-8残基，成本将明显下降； • 亲合作用复杂，配基的寻找困难，而采用分子动力学模拟的方法将实验以模拟的形式进行，能大大减少实验量筛选出合适的配基。研究目标：设计寻找合适的短肽配基，摸索其吸附洗脱的条件，验证配基稳定性，分离sc质粒获得高回收率和纯度。

配基筛选 pDNA自主复制连接介质 pDNA粗分离静态吸附洗脱条件实验配基稳定性实验室介质得率、纯度直接分离粗料液

pDNA粗液的制备 • pDNA自主复制：可采用质粒pUC19(0.01 lg/l, Invitrogen)转化大肠杆菌DH5α（此处可用其他现有质粒代替，只要含Lac操纵子即可），取50μL菌液放入50mL LB培养基中培养24h，温度保持37℃。活化后的菌株再依比例放大到500ml或1L培养基中。 • pDNA的提纯：制备质粒粗液收集500mL菌液至大离心管中，冷冻离心，4℃，4800rpm离心15min，弃上清。将沉淀重溶于18mL溶液I中。加入40mL新配置的溶液II，室温放置10min。加入20mL用冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，4℃冰箱放置10min。3047转头，4℃，4800rpm离心15min。将上清移至新离心管中，再次3047转头，4℃，4800rpm离心15min，重复操作两次。将上清过滤(用滤纸和漏斗)至新离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。3047转头，室温下，4800rpm离心15min。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，#3047转头，室温下，4800rpm离心15min。3mLTE溶解沉淀，转移至40mL小离心管中。采用promega公司质粒提取试剂盒和聚乙二醇纯化法制备质粒纯品。

配基选择 • 配基的筛选：参考文献（Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes）所构造的LacI-LacO结合模型，通过rosetta软件进行分子动力学模拟。通过公司合成此配基，进行下一步实验。 • 配基连接：可采用商品化介质或实验室现有介质，，配基的合成包括了乙酰化以保证标准长度肽的N端包含Cys残基，因为Cys残基中的硫醇基能通过共轭作用来控制配基的固定化的方向。过程中可加入5%（体积）DMSO，能够增加小分子配基的溶解性能。

静态吸附试验 进行三至五次平行实验，以减少操作误差选用同一批介质，以减少介质造成误差最佳吸附时间检测方法：用分光光度计测量粗液、上清液、清洗液的核酸浓度，再通过物料平衡计算吸附量。（先用标准样品绘制标准曲线，然后用光度计测量A260/A280的比值，对比标准曲线可得其浓度）最佳盐浓度最佳pH值

洗脱实验 填充色谱柱，进行浓度（或pH）梯度洗脱，可选择8个左右浓度跨度。色谱检验出峰情况，收集样品峰，用琼脂糖凝胶电泳检验其纯度，计算pDNA收率： pDNA收率=分离纯化后样品pDNA浓度×收集目标峰体积×pDNA纯度/纯化前样品pDNA浓度×上样粗品体积×100%。非特异性结合实验：（选做）此实验主要为了考察空白介质对pDNA的滞留作用（由所用介质的不同，作用原理不同，如静电作用，空间排阻作用等）。采用不同浓度的pDNA与空白介质相互作用，然后与同水平的有配基的介质吸附水平做横向对比，所得结果分析其非特异性的结合所造成的误差。洗脱流速：填充色谱柱，选择不同流速进行洗脱，流速可根据文献（如1 ml/min、2 ml/min、5 ml/min、10 ml/min）。然后通过比较不同流速下的样品峰图形，查看图形中峰的分离情况（主要是峰与峰之间是否有连带），选择分离效果最好的峰的流速。洗脱时间：选定合适的洗脱流速，从色谱图中看目标样品峰完全分离所用的时间可知。洗脱体积：得到了流速和洗脱时间便可计算出洗脱体积。洗脱体积=洗脱流速×洗脱时间

稳定性——短肽稳定性实验 化学药品缓冲液（蛋白变性剂）浸泡24h，再将介质用TE缓冲液反复洗净，适宜条件下吸附，分光光度计测吸附量修饰过的介质

稳定性——介质连接稳定性实验 吸附—洗脱—再生计算每次pDNA的得率，前后比较，考察短肽配基结合介质之上的稳定性能。填柱修饰（重复3-7次）

扩展内容 • 与实验室现有介质用实验室的介质如磁性介质或凝胶球，形成磁化床或制造整体住 • 直接分离裂解液细胞破碎后的裂解液含大量杂质（宿主DNA、RNA、宿主蛋白、细胞壁物质、内毒素等），蛋白配基能够已成功处理了裂解液，而氨基酸配基由于特异性不强，无法直接处理。短肽配基有比氨基酸更强的选择性，可尝试用之前实验所获得的配基直接处理裂解液，考察分离效果。同时也要考虑介质问题

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