Biologia molekularna roślin

1. Biologia molekularna roślin 2008/2009

2. Program • Podstawowe koncepcje i metodologia biologii molekularnej roślin. • Rośliny modelowe. • Genetyka klasyczna (forward genetics) i odwrotna genetyka (reverse genetics) w analizie funkcji genów u roślin – analiza na przykładach. • Genomika roślin: kompletne sekwencja, struktura i ewolucja genomów roślinnych. • Współczesne metody po-genomiczne: transkryptomika (mikromacierze DNA), proteomika (analiza białek za pomocą spektrometrii mas), inne –omiki. • Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja: zjawisko RNAi (interferencja RNA), chromatyna i dziedziczenie epigenetyczne. • Organizacja i regulacja ekspresji genów organellarnych. • Stres, fitohormony i transdukcja sygnałów u roślin. • Genetyczna regulacja rozwoju embrionalnego i procesu kwitnienia. • Współczesna biotechnologia roślin a etyka.

3. Wykład 1 • Podstawowe koncepcje i metodologia biologii molekularnej roślin

4. Cykl życia

5. Centralny dogmat biologii molekularnej- idea • DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja Organizm

6. Centralny dogmat-realizacja • W organizmach informacja przepływa od DNA (kwasów nukleinowych) do białek, nigdy odwrotnie.

7. CD stwierdza, że informacja zawarta w genach (DNA) przyjmuje ostatecznie fizyczną postać fenotypu (białka). Organelle roślinne są zarówno pochodzenia eukarotycznego (jądro), jak i prokariotycznego (chloroplasty, mitochondria). Chloroplasty i mitochondria, podobnie jak DNA, zawierają DNA. Zasada CD jest realizowana we wszystkich organellach. Odwrotna transkrypcja nie występuje w chloroplastach i w mitochondriach. W mitochondriach roślinnych występuje edytowanie mRNA. Centralny Dogmat (CD) w komórce

8. Elementy budowy DNA • Składniki DNA: • deoksyryboza (oznaczenie atomów C: 1’-5’); • fosforan (uczestniczy w wiązaniu: deoksy-5’-P-3’-deoksy); • zasada azotowa: A,T,G,C – dołączona do C-1’ deoksyrybozy.

9. Schemat budowy nici DNA 5' 3’ • Łańcuch utrzymywany przez wiązania 3’-5’ fosfodiestrowe tworzy szkielet cząsteczki

10. Polarność nici DNA • Na jednym końcu nici DNA występuje wolna grupa C3’-OH (3’ koniec) a na drugim – C5’-OH (5’ koniec).

11. Zasada budowy DNA • DNA jest dwuniciowy; ten typ budowy cząsteczki umożliwia zjawisko komplementacji. • W dwuniciowym DNA naprzeciwległe (antyrównoległe) nici mają przeciwną polarność (3’-5’ vs. 5’-3’). • Cząsteczka jest stabilizowana przez wiązania wodorowe miedzy zasadami i wiązania hydrofobowe pomiędzy równolegle nad sobą ułożonymi płaszczyznami zasad (stacking).

12. A-T

13. G-C

14. DNA: struktura formy B

15. DNA: widok z góry

16. Geometria DNA w formie B 1.9 nm

17. Przyczyna różnic w wielkości rowków w DNA

18. Rowki i ‘stacking’ (ułożenie warstwowe) zasad w DNA

19. Ułożenie w sąsiadujących parach zasad

20. Różne formy DNA

21. DNA opisany przez W-C – w formie B. Obecnie wiadomo, że DNA może występować także w innych formach. Główna różnica między formami: kierunek skręcenia helisy A, B, C – helisa prawoskrętna Z – helisa lewoskrętna (występuje in vitro w wysokim stężeniu soli) W komórce – głównie forma B. Forma Z może istnieć w warunkach niskiego stężenia soli (w komórce), gdy w DNA występują naprzemienne ciągi puryn i pirymidyn, np. poli-GC lub poli- AT, lub 5-metylo-cytozyna. A 11.0 zasad/skręt śr. 23A B 10.0 zasad/skręt, śr. 19A C 9,3 zasad/skręt, śr 19A Z 12.0 zasad/skręt, śr. 18A Formy DNA - parametry

22. DNA w formie B i DNA w formie Z

23. Replikacja DNA • Reakcja: dATP, dCTP, dGTP, dTTP -> Polimer DNA + PPi (PPi + H20 -> hydroliza pirofosforanu napędza reakcję) Wymagane: Enzym – polimeraza DNA, matryca DNA, Mg++, primer

24. Synteza DNA • Mechanizm: 3’-OH cząsteczki cukru atakuje 5’ fosforan w trifosfodeoksynuklozydzie. • Każdy kolejny nukleotyd dodawany jest do 3’ końca kwasu nukleinowego. • Reakcja związana jest z ukierunkowaną 5’->3’ aktywnością polimerazy DNA

25. Kierunek syntezy nici DNA • Nić DNA rośnie zawsze w kierunku 5’ -> 3’.

26. Enzymologia replikacji DNA - I • Większość danych o syntezie DNA z badania bakterii. • U bakterii dwie ważne polimerazy DNA: I i III. • DNA polimerazy wymagają „primera” w postaci fragmentu nici polinukleotydowej, nie potrafią tworzyć nici od „zera”. • W celu rozpoczęcia nici od „zera” polimeraza RNA (primaza) sytntetyzuje primer RNA (RNA polimeraza sama nie wymaga primera). W wypadku wydłużania nici DNA, istniejąca nić służy jako primer. • DNA polimerazy I i III mają aktywność 3’->5’ egzonukleazy (tj.w kierunku przeciwnym do kierunku polimeryzacji) zdolną do niszczenia nowo zsyntetyzowanej nici (tzw. ‘proofreading’) w celu naprawy błędnie włączonych nukleotydów. • Problemy w trakcie replikacji: gdzie zacząć (origin), rozwinięcie helisy i stabilizacja rozwinięcia (rep protein, helikaza II), wytworzenie primera, synteza DNA, uwolnienie nowych łańcuchów, topologia.

27. Enzymologia replikacji DNA - II • Nić prowadząca – początek syntezy DNA, synteza bez problemów 5’->3’. U eukariontów: DNA polimeraza δ (delta) • Nić opóźniona – primaza wiąże się do sekwencji na nici opóźnionej, odsłoniętym przez białko rep, i syntetyzuje fragment RNA – primer dla nowej cząsteczki polimerazy DNA (u eukariontów Polimeraza ε (epsilon). Primaza przesuwa się wzdłuż nici opóźnionej i powtórnie zaczyna syntezę RNA. W rezultacie, nić składa się z serii krótkich fragmentów DNA, każdy z primerem RNA na 5’ końcu. Są to tzw. ‘fragmenty Okazaki’.

28. Replikacja DNA • Replikacja nici prowadzącej i nici opóźnionej przebiega niejednakowo. delta epsilon AT-bogata sekwencja ‘origin’

29. Telomeraza: replikacja końców cząsteczek DNA • Problem: na końcu nici opóźnionej nie ma miejsca na syntezę primera RNA • Rozwiązanie: wydłużyć nić opóźniną

30. Efekt telomerazy

31. Mechanizm działania telomerazy

32. Informacja w DNA

33. Replikacja i mutacje • Mutacje są utrwalane w trakcie replikacji

34. Chromosomy

35. Chromosomy Arabidopsis thaliana -wygląd w komórce

36. Chromosomy Arabidopsis thalianaschemat organizacji

37. Hierarchiczna organizacja chromosomów

38. Schemat nukleosomu

39. Chromatyna – względne upakowanie DNA

40. Zasada sekwencjonowania

41. Wydruk z sekwenatora

42. Reakcja PCR

43. PCR i sekwencjonowanie

44. Geny w chromosomach

45. Sekwencjonowanie chromosomu

46. Mapa genowa fragmentu chromosomu Arabidopsis

47. Transkrypcja i translacja

48. Rodzaje RNA - I • tRNA – [Przenośnikowy, transportujący], mały (65-110 nukleotydów), przenosi aktywowane aminokwasy do rybosomu, długożyjący (stabilny). • rRNA – [Rybosomowy], tworzy (wraz z białkami) rybosomy. Jeden z rRNA jest katalizatorem tworzenia wiązania peptydowego (rybozymem). Różne rodzaje i wielkość (4700 – 120 zasad). rRNA eukariontów i prokariontów zasadniczo się różnią. Długożyjący (stabilny) • mRNA –[Matrycowy, Informacyjny], nośnik przepisanej z DNA informacji o sekwencji aminokwasów w białku. Ma cechy umożliwiające przyłączanie się do rybosomów i udział w syntezie białka. Wielkość zależna od wielkości kodowanego polipeptytdu. Zróżnicowana trwałość, raczej mało stabilny.

49. Rodzaje RNA - II • Niekodujace RNA (ncRNA) – nie zaangażowane bezpośrednio w syntezę białka. Biorą udział w wielu innych procesach komórkowych, jak: regulacja transkrypcji, replikacji DNA, obróbki i modyfikacji innych cząsteczek RNA (transkryptów). • Długość od 21 do > 10 000 nukleotydów, w zależności od rodzaju i funkcji • Przykłady: XIST RNA – inaktywuje jeden z dwóch chromosomów X u samic; snRNA – obróbka dużych prekursorów RNA w jądrze; snoRNA – udział w tworzeniu rybosomów i telomerów; miRNA – udział w regulacji ekspresji mRNA; siRNA – małe RNA, wiążą się do komplementarnych sekwencji RNA znacząc je w ten sposób dla systemu niszczącego (endonukleazy RNA).

50. tRNA-Phe z drożdży