Valérie Gabelica, Frédéric Rosu, Nives Galic, Edwin De Pauw Université de Liège (Belgique)

1. Dissociation en phase gazeuse de complexes non-covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance moléculaire. Réalités et espoirs. Valérie Gabelica, Frédéric Rosu, Nives Galic, Edwin De PauwUniversité de Liège (Belgique)

2. Les interactions non covalentes Ponts salins Liaisons Hydrogène Dipole-Dipole P-P Dipole-Dipole induit Interactions « hydrophobes »

3. Comment produire ces espèces « fragiles » en phase gazeuse Ln k Désorption d’ions Décomposition 1/T

4. Les sources d’ions: la source MALDI From Leonid V. Zhigilei web site From Finnigan

5. Les sources d’ions: l’électrospray Source Electrospray Concentration: 10-6 – 10-3 M Solvent: H2O (+ MeOH, CH3CN) Cone de Taylor

6. Manipulation des ions Activation par collisions MS/MS MS1 MS2 Régimes d’activation: haute énergie: keV (secteurs) Basse énergie: quadrupôles Slow heating: pièges à ions !!! Source CID!!!

7. Les dissociations unimoléculaires [Ligand + Substrat] Ligand + Substrat Er A+ + B Einternal E0(1) E0(2) (AB)+ Reaction coordinate kuni [E(A+) + E(B)] – E(AB+) = E0 - Er On mesure la STABILITE CINETIQUE ou LABILITE

8. Constantes de vitesse statistiques RRKM RRK • Les calculs sont difficiles pour les systèmes à grand nombre de degrés de liberté • Peut-on toujours appliquer les modèles statistiques ? • Comment obtenir la distribution d’énergie interne ? • L’activation collisionnelle des systèmes à grand nombre d’atomes est mal connue

9. Les spectromètres de masse Le QTOF (MS2)

10. Les spectromètres de masseLe piège à ions (MSn) Temps d’activation: 3 ms to 10 s

11. Exemples • Duplexes DNA • Complexes Duplexes-Ligands • Complexes cyclodextrine-ligands • Complexes Proteine(s)-Proteine(s)

12. A T G C Les duplexes ADN On peut calculer l’énergie d’interaction sur base d’un modèles de proches voisins: nombre de liaisons H CG:3 AT:2 P-P stacking

13. L’évolution des duplexes DNA • Dissociation • Fragmentations B B

14. Les duplexes DNA et leurs complexes Ligands du petit sillon Intercalants

15. Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ? quadrupole (t  1-10 µs) Duplex: d(CGCGAATTCGCG)2 piège à ions (t = 30 ms)

16. Comparaison entre duplexes d’énergie d’interaction croissante

17. Compétition dissociation-fragmentation

18. Origine de l’influence du régime de collisions DDS - + + - Activation rapide Chauffage lent

19. Maintien de la structure en double hélice en phase gazeuse 5’-AAATCGCGGCGCTAAA-3’ 3’-TTTAGCGCCGCGATTT-5’ DHn-n = -136.8 kcal mol-1 5’-GGGCTATAATATCGGG-3’ 3’-CCCGATATTATAGCCC-5’ DHn-n = -125.3 kcal mol-1 5’-AGACTGTGAGTCAGTG-3’ 3’-TCTGACACTCAGTCAC-5’ DHn-n = -122.6 kcal mol-1  5’-GGGCTTTTAAAACGGG-3’ 3’-CCCGAAAATTTTGCCC-5’ DHn-n = -135.9 kcal mol-1

20. Complexes Duplexes-drogues Intercalatants Minor groove binders ligands du petit sillon ou 1:1 complex 2:1 complex Intercalation « random » entre les paires de bases

21. MS/MS pour la détermination rapide du mode de complexation • Complexes5- avec ligands du petit sillon (GC+H)5- Hoechst (NR3H+) 30 eV G3- C2- (GC+N)5- Netropsin (NR4+) 30 eV (G+N)3- C2- • Complexes5- avec intercalants (GC)5- (GC+A)5- Amsacrine (neutral ) 12 eV (GC+E)5- G3- (G+E)3- C3- C2- (C+E)2- Ethidium (NR4+) 25 eV

22. Contribution de l’intercalation à l’énergie libre de liaison Changement de conformation Contribution entropique et enthalpique (contribution à DH >0, DS > 0) Transfert hydrophobe Contribution entropique (DS < 0) Création de liaisons intermoleculaires Effet enthalpique (DH < 0)

23. Stabilité cinétique relative des intercalants (1) Daunorubicin (R = H) Doxorubicin (R = OH) R = OH ds+D5- ds5- R = H ds+D5- ds5- Spectres MS/MS dans des conditions identiques

24. Intercalants: intercalation « random » Stabilité cinétique relative des intercalants (2) ds+C5- Cryptolepine Neocryptolepine ds+NeoC5-

25. Comportement en solution • Titrages, mesure des constantes de stabilité ou expériences de compétition

26. (ds)4- (ds)5- (ds+C)5- (ds+C)4- (ds+2C)4- (ds+2C)5- (ds)5- (ds)4- (ds+neoC)4- (ds+neoC)5- (duplex+C)5- duplex5- duplex5- (duplex+neoC)5- Spécificité des complexes en solutionvsstabilité cinétique en phase gazeuse En solution: ESI full scan En phase gazeuse MS/MS Specificité de séquence

27. (FP-O-FP+ C)+ (FP-O-FP)+ (FP)+ (FP)+ (FP-FP+neoC)+ (FP+neoC)+ (FP-O-FP)+ (FP-FP)+ Détermination de la cible biologique Complexe hème-cryptolepine Complexe hème-neocryptolepine. Le mode de fixation est différent

28. Les complexes de cyclodextrines COO– COO– CH2 n Interactions hydrophobes fortes dans l’eau Plus longues sont les chaînes, plus forts les complexes Conformation in solution L’électrospray peut-il produire des complexes spécifiques?

29. L’information reste-elle spécifique en phase gazeuse ? Taux de survie Complexes 2- Complexes 1-

30. Influence de la forme des ions From Clemmer’s web site

31. Exemples de fragmentation « shape dependant » Résultats du groupe de D. Clemmer

32. Topologie des complexes par MS/MS Deduction de la symétrie des complexes: GroEL (C. Robinson, Current opinion in biology, 1999) 1-mer 7-mer 14-mer Energie Nombreuses applications aux complexes multiproteines

33. Hot topics • Mesures de vitesse d ’échange H/D (S.R. Kass, JASMS, sous presee) • ECD et analyse du maintien des liaisons non covalentes durant la fragmentation (R. Zubarev Rapid Comm. Mass Spectrom.2001; 15 (19) : 1849-1854.) • Dissociation avec répartition inégale des charges (J.S. Klassen, Anal. Chem, 2001, 73, 4647-4661)

34. Conclusions: nouvelles questions La spectrométrie de masse et la MS/MS sont utilisées dans le cas de complexes de plus en plus « gros » . Si, dans les cas favorables, les complexes semblent transportés « intacts » et de manière quantitative en phase gazeuse (MS simple), on ne connaît quasi rien: • De la conformation des ions produits • De l’énergie transférée lors des collisions (source CID ou MS/MS) • Des déplacements cinétiques qui peuvent être importants • De la contribution entropique • De la validité des théories statistiques