Testes de sensibilidade: difus o por disco e E-test

1. Testes de sensibilidade: difus�o por disco e E-test Daniel Archimedes da Matta Laborat�rio Especial de Micologia-DIPA UNIFESP � EPM lemits@terra.com.br

4. Desenvolvimento de testes de susceptibilidade a antif�ngicos Aumento da necessidade de testes de susceptibilidade: in�meros relatos de resist�ncia a antif�ngicos novas drogas dispon�veis CLSI � Clinical and Laboratory Standards Institute (antigo NCCLS): estudos multic�ntricos para padronizar testes de susceptibilidade a antif�ngicos com leveduras e fungos filamentosos (�guidelines� para dilui��o em caldo)

6. Vari�veis relevantes na padroniza��o do ensaio Solubiliza��o de drogas Tamanho do in�culo Meio de composi��o definida e tamp�o Temperatura do ensaio Tempo e crit�rios de leitura Avalia��o da correla��o cl�nica Estabelecimento de �breakpoints�

7. Metodologia NCCLS: dilui��o em caldo Meio: In�culo: Temperatura: Tempo de leitura: Crit�rio de leitura: RPMI-1640 tamponado c/MOPS 0,5 a 2,5 x 103 cels/mL 35�C 48 horasAnfo: inibi��o total Az�is: inibi��o significativa (trailing)

8. Correla��o in vitro versus in vivo  CIM n�o � vari�vel f�sica ou quimicamente mensur�vel, sofrendo influ�ncias biol�gicas diversas Fatores relacionados ao hospedeiro s�o geralmente mais importantes que testes de susceptibilidade para definir resposta terap�utica Susceptibilidade in vitro pode n�o implicar em sucesso terap�utico Resist�ncia in vitro geralmente associa-se a falha terap�utica

9. A regra do �90-60� Infec��es por microrganismos suscept�veis repondem � terap�utica apropriada 90% das vezes Infec��es por microrganismos resistentes respondem � terap�utica 60% das vezes

18. Descri��o da Metodologia Placa de petri 90mm para testar um �nico antif�ngico Placa 120mm para ate 3 antif�ngicos Fita pl�stica contendo os antif�ngicos RPMI 1640 + 1.5% de agar suplementado com 2% de glicose Microrganismo puro com subcultivo recente (18-24h) 0.5 de McFarland (espectrofot�metro) Swab Temperatura de incuba��o: 35�C Tempo de incuba��o: 24h (az�licos e 5FC) e 48h (anfotericina B) Crit�rio de leitura: inibi��o parcial (az�licos e 5FC) e total (anfotericina B)

24. Resist�ncia a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST Candida lusitaniae possui Resist�ncia intr�nsica a anfotericina B 47 isolados 9 isolados eram reconhecidamente resistentes Macrodilui��o NCCLS em RPMI e AM3 (Antibiotic Medium 3) ETEST em RPMI e AM3 com leitura de 24h e 48h > 0.38 mg/ml Resist�ncia (crit�rio sugerido por Clancy e Nguyen, 1999)

25. Resist�ncia a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST

26. Resist�ncia a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST

27. Correla��o entre Etest e microdilui��o para isolados de Candida spp. Colombo et al. (1995) Martin-Mazuelos et al. (1999) Chryssanthou (2001) Barry et al. (2002) Morace et al. (2002) Matar et al. (2003) Pfaller et al. (2004)

28. Disco difus�oDocumento M44-A (aprovado) � NCCLS 2004

32. Cuidado na distribui��o do in�culo

33. Isolado Sens�vel , com halo de inibi��o bem definido

36. Concord�ncia de resultados entre sistemas comerciais de avalia��o de susceptibilidade ao fluconazol e o NCCLS c/ 48 horas de incuba��o

38. Correla��o entre Disco difus�o e microdilui��o para isolados de Candida spp. frente ao fluconazol Barry et al. (2002) Morace et al. (2002) Matar et al. (2003) Pfaller et al. (2004)

39. Inoculado com swab com uma suspens�o de c�lulas ajustado pelo turbidimetro em escala 0,5 Mc Farland Placas incubadas a 35oC e leitura de 18 a 24 h Todos os isolados foram preservados em �gar , sendo enviados para o laborat�rio central em Iowa para realiza��o de identifica��o , teste de susceptibilidade e posterior congelamento. Foram selecionados isolados de Candida spp com signific�ncia cl�nica nos s�tios de infec��o (sangue e s�tios esterilizados) que causam doen�a invasiva atrav�s de trabalhos em hospitais sentinela da Am�rica do Norte, Am�rica Latina, Europa, �frica e �sia . Monitoramento do di�metro do halo do disco para fluconazol reportado em 54 diferentes centros m�dicos entre 2001 e 2002.

40. Resultados do halo de inibi��o dos centros participantes X NCCLS dos Laborat�rio Refer�ncia

41. Resultados do halo de inibi��o X NCCLS � ambos realizados no laborat�rio refer�ncia

42. �� importante ter em mente que os crit�rios para teste de susceptibilidade a antimicrobianos s�o resultado da colaborac�o de v�rias ci�ncias, f� e trabalho��