质粒酶切、鉴定及 DNA 片段的凝胶回收

质粒酶切、鉴定 及DNA片段的凝胶回收

一. 实验目的 1.了解质粒酶切及电泳鉴定原理。 2. 掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术。

第一部分 质粒的酶切及电泳鉴定

一. 实验原理 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 双链，形成一定长度的DNA 片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT

_ 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。 +

酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水 注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。 1，DNA：自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。 2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。 3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA。

4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。 5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。 6，双酶切因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况： 1) 两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。 2) 两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。

二. 仪器和试剂 1．主要仪器（1） 1.5mL塑料离心管（2）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支（3）台式高速离心机（120 00r/min）（4）水浴锅、电泳仪、电泳槽 2．材料重组质粒pMD19-b （插入外源基因大小约500bp）

3．试剂 （1）限制性内切酶BamH I、 HindⅢ及缓冲液K ；（2）1×TBE 缓冲液：称取Tris 10.88g、硼酸5.52g 和 EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10 倍。（3）EB 染色液：终浓度为0.5μg/mL。

三. 操作步骤 1. 反应体系的建立: （25μl体系） H2O 5.5 μl 质粒DNA(100 ng/μl) 15 μl 10×酶切缓冲液(K buffer) 2.5μlBamHⅠ(5 U/μl) 1μl HindⅢ 1μl 混匀(12000 rpm离心5 sec) 2. 37 ℃水浴3 h-4h。 3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应，或加入2ul loading buffer终止反应。 4. DNA 琼脂糖凝胶电泳检测

酶切图 质粒DNA 质粒酶切电泳图

操作注意事项：1. 吸样量一定要准确;2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶;3. 要求在冰上操作，并充分混匀;4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染;5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

重组所用质粒载体（2.692kb） pMD19载体结构

第二部分 DNA的凝胶回收

实验原理 传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收。现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收。

仪器和试剂 1. 仪器：电泳仪，水浴锅，离心机 2. 材料：酶切的DNA样品 3.试剂：北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒 Cat.NO.MK005

DNA酶切条带回收步骤 1 按凝胶重量：溶胶液=1:3加入溶胶液 60℃溶胶10min-20min 2 将溶胶液转移至吸附柱 12,000rpm离心30s，弃废液加入20ul洗脱液，静置5min 3 4 吸附柱移至新的1.5ml离心管加入500ul漂洗液 12,000rpm离心2min,弃废液，重复3次 12,000rpm离心5min 5 弃洗脱柱，保存样品

约2690bp 约600bp 回收电泳图

实验六 DNA片断的连接

一. 实验目的 学习核酸片断连接的原理和方法二. 实验原理 (质粒酶切与鉴定 ) DNA片段之间的连接主要是在T4 DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。

连接酶：把基因连在一起

影响DNA连接反应的因素 1、连接缓冲液的影响： 1） 20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系； 2）10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应； 3）1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性， 4）25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 5）0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。注：含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。

2、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果。 3、酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。 4、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。

仪器和试剂 1. 仪器：离心机，水浴锅 2. 材料：回收的DNA样品 3.试剂：1）T4 DNA连接酶 2）10X T4 DNA ligase buffer：Tris-HCl（pH7.6）； MgCl2；DTT；ATP。

三. 操作步骤 1）连接反应液的制备（10ul体系）：载体DNA（大片段）： 6 μl；插入片段（小片段）： 2μl； 10× T4 DNA ligase buffer： 1 μl； T4 DNA连接酶： 1 μl 2） 4℃反应过夜（>16h）。

注意： • DNA纯化回收后, 电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带, 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。 • 2.当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。 • 当连接效率仍然无所改变时，应当对DNA进行纯化后 • 再反应。 • 3. 连接反应液可以直接用于转化。另外，当转化DNA量 • 较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法纯化 • DNA。

问题思考？ 1．核酸片段双酶切与单酶切相比有何优点？进行双酶切操作时应注意些什麽？ 2. 酶切片段的回收与连接时有哪些注意事项。

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