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第三章 细胞生物学研究方法. 观察（原版 P143 ） 自 1680 年荷兰学者列文虎克 (Leeuven hoek) 用单显微镜 ( 单透镜 ) 第一次看到酵母活细胞以来 , 人们一直在努力改革和发展观察手段，来研究细胞较深层次的形态和结构。 今天人们已经有了具有原子尺度高分辨本领的扫描隧道显微镜。 与此同时人们还创造了一系列对细胞组分和细胞生理活动进行详尽分析的方法和手段 , 它们揭示了各种细胞结构及生物大分子在细胞内的功能和作用。. 为了提供大量均一的细胞作为生物学的研究材料 , 人们又发展了一系列细胞培养技术。 细胞形态结构的观察技术，
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观察（原版P143） 自1680年荷兰学者列文虎克(Leeuven hoek)用单显微镜(单透镜)第一次看到酵母活细胞以来,人们一直在努力改革和发展观察手段，来研究细胞较深层次的形态和结构。 今天人们已经有了具有原子尺度高分辨本领的扫描隧道显微镜。 与此同时人们还创造了一系列对细胞组分和细胞生理活动进行详尽分析的方法和手段,它们揭示了各种细胞结构及生物大分子在细胞内的功能和作用。
为了提供大量均一的细胞作为生物学的研究材料,人们又发展了一系列细胞培养技术。为了提供大量均一的细胞作为生物学的研究材料,人们又发展了一系列细胞培养技术。 细胞形态结构的观察技术， 细胞组分及功能的分析技术 细胞培养技术是细胞生物学赖以发展的三大技术手段。
第一节 细胞形态结构的观察方法 一 各种显微镜 1、普通光学显微镜（Light microscope）的分辨本领 各种显微镜识别微观物象的能力常用分辨力（resolving power）的概念来表示。分辨力是指能够区分相近两点的最小距离，能够区分的两点间距离越小，表示显微镜的分辨力越高。分辨力亦称分辨本领。显微镜的分辨力是由物镜决定的。它和物镜的镜口率、照明光线的波长有直接关系。分辨力可按下式计算：
0.61(λ) R=---------- ……………………(a) NA (Sin a1/2) R-------分辨力 (-------照明光源的波长 NA------镜口率（数值孔径）
n-------物镜与标本间的介质的折射率 (a------物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度（2-1）。镜口角(小于180(，故Sin1/2的最大值也小于1。
2 暗视野显微镜 暗视野显微镜是因为视野内不能直接看到照明光线,只能看到被检物体散射或衍射的光线。故视野内呈黑暗状态。由于被检物体表面散射的光亮.才使我们能够在黑暗的视野中观察到被检物体的外形和运动。 普通显微镜的最高分辨力如上所述为 0.2微米,而暗视显微镜虽然对被检物体的细微构造分辨不清,但却可看到0.004微米以上的微粒子的存在。这是普通光学显微镜所不具有的特性。
3 相差显微镜 三十年代Zernike.F.提出相差显微镜(phase contrast microscope)的原理和设计,四十年代开始制造相差显微镜出售。由于有了相差显微镜,在一定程度上克服了上述困难可以直接看到活细胞中的结构变化。
4、荧光显微镜 某些物质受紫外线照射时发出荧光(可视光线),这种物质称荧光物质。例如维生素A、核黄素、硫胺素等都是细胞内的天然荧光物质。用荧光显微镜(fluorescence microscope)可以观察这些荧光物质在细胞内的分布位置。另外给细胞中加入荧光染料(如中性红、甲基绿、吖啶橙、吖啶黄、刚果红等)可使细胞中某些物质受紫外线照射诱发出荧光。例如固定的切片标本,用吖啶橙染色,经紫外线照射时可使细胞内的核糖核酸(RNA)发生红色荧光,脱氧核糖核酸(DNA)发生绿色荧光。
5，电子显微镜(electron microscope) 可见光的波长制约了普通光学显微镜的分辨能力。人们在考虑可能替换的光源。1926年有人发现了磁场对电子束的聚焦效应，接着鲁斯卡(Ruska)借助于磁力线圈把电子束聚焦于尽可能小的点上。这两项研究成果奠定了制作电子显微镜的基础。1831年鲁斯卡等人通过试验证实了和光学成象的几何原理一样，电子照射的物体也可以用磁电子透镜分二次放大的形式显示出来。1933年鲁斯卡制成了第一台电子显微镜，这台电镜被看作是当代各种型号电镜的祖先。他得到了500 A的图象。
1939年鲁斯卡极大的改善了电子显微镜，西门子公司开始批量生产并成功的将电子显微镜推向了市场。1986年鲁斯卡与扫描隧道显微镜的发明人拜宁（Binning)等一起被授于诺贝尔物理奖。鲁斯卡在80高龄得到这次殊荣，是为了奖励他在24岁时发明的电子显微镜，他可能是历史上最老又最年轻的诺贝尔奖获得者。1939年鲁斯卡极大的改善了电子显微镜，西门子公司开始批量生产并成功的将电子显微镜推向了市场。1986年鲁斯卡与扫描隧道显微镜的发明人拜宁（Binning)等一起被授于诺贝尔物理奖。鲁斯卡在80高龄得到这次殊荣，是为了奖励他在24岁时发明的电子显微镜，他可能是历史上最老又最年轻的诺贝尔奖获得者。
电子显微镜是用电子束作为照明的光源.电子束的波长远比光波的波长短.电子显微镜是用电子束作为照明的光源.电子束的波长远比光波的波长短. 其次,电子显微镜使用的是电子透镜。光学透镜是由玻璃制成的可见物质透镜.与此相反，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,他是由磁或电所行成的局部空间来起透镜的做用. 那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即亮度差,是因被检物的不同结构吸收光线的强弱程度不同造成的。
那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即亮度差,是因被检物的不同结构吸收光线的强弱程度不同造成的。而电镜的成象原因是,入射电子与物质原子碰撞后产生散射,被检的不同部位有不同的散射度,这样就形成了电子象的浓淡.电子束的散射度是由物体的密度与厚之积,以及加速电压的大小决定的。那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即亮度差,是因被检物的不同结构吸收光线的强弱程度不同造成的。而电镜的成象原因是,入射电子与物质原子碰撞后产生散射,被检的不同部位有不同的散射度,这样就形成了电子象的浓淡.电子束的散射度是由物体的密度与厚之积,以及加速电压的大小决定的。
6．扫描隧道显微镜(Scanning tunneling microscope,简称 STM)。 人类永远不会停止对微观世界的探索，在电子显微镜发明大约半个世纪后，1981年拜宁（Binning）等又发明了扫描隧道显微镜它的成象原理完全不同于光镜和电镜。。基于量子力学原理，研究者们发展出了一系列高分辨显微镜。这些发明为人类打开了通向微观世界的一扇又一扇大门，使人类真正进入了纳米世界。
STM的探头有一根探针，针尖只有一个原子的大小，探针的针尖接近但不接触观测样品的表面并且同时进行扫描.根据量子物理学原理，当针尖上的原子与样品表面的原子的距离小于1纳米时，针尖和样品间会产生隧道效应，即产生隧道电流.通过记录隧道电流的变化就可以获得样品表面原子排列的情况并把它转化为图像。STM的探头有一根探针，针尖只有一个原子的大小，探针的针尖接近但不接触观测样品的表面并且同时进行扫描.根据量子物理学原理，当针尖上的原子与样品表面的原子的距离小于1纳米时，针尖和样品间会产生隧道效应，即产生隧道电流.通过记录隧道电流的变化就可以获得样品表面原子排列的情况并把它转化为图像。 STM具有其他显微镜不可比拟的功能和特点：（1）具有高分辨能力。（２）具有搬移能力。STM不仅可以直接观察物质表面的原子排列情况，而且还可以通过探针对物质表面的原子或分子进行搬移.从而人们可以按着自己的意愿在原子水平上进行重构或组建新的材料。
（3）具有刻蚀能力。STM能对物质表面进行刻蚀，通过计算知道一个大头针大小的地方就能记录下来象”红楼梦”那样的一部书.（4）具有在多种多样下的工作能力。对于生物学研究尤其重要的是STM可以在真空、大气等多种条件下工作。（5）不破坏样品，STM在工作时既不接触样品又没有高能电子束的轰击.因此，可以避免样品的变形。（3）具有刻蚀能力。STM能对物质表面进行刻蚀，通过计算知道一个大头针大小的地方就能记录下来象”红楼梦”那样的一部书.（4）具有在多种多样下的工作能力。对于生物学研究尤其重要的是STM可以在真空、大气等多种条件下工作。（5）不破坏样品，STM在工作时既不接触样品又没有高能电子束的轰击.因此，可以避免样品的变形。 第二节 细胞组分及功能的分析方法
这些方法大致可分为三种 ：第一种方法是把细胞及大分子分离出来进行研究，即分离分析法； 第二种是不破坏细胞或组分，在原位进行组分和功能的研究，既原位分析法 .第三种则是在细胞或细胞组分生活状态下进行的动态分析法。当然观察方法和分析的方法并没有严格的界限。
一、分离分析法 1、细胞分离技术 目前流式细胞术和分类术（flow cytometry and serting,FCM, FCS)是一项较新的开拓性技术，可以用此项技术来分离细胞。 流式细胞计可在1小时内分类收集一亿八千万个细胞，纯度可达90—99%。可在1分钟内测出10000个细胞的DNA、RNA、蛋白质含量和细胞体积。此仪器应用广泛但价格十分昂贵（原版P167）。
2、细胞器及生物大分子的分离技术 离心机是一种借离心力把颗粒从中心向外推移的机器，当离心力超过地球引力时，悬浮在液体里的颗粒就会离开中心向外沉降。 1920年代，瑞典化学家斯维德伯格（Theodor Svedberg)发明了一种超速离心机，它的转数可达每分钟十几万转，产生的离心力相当于地心引力的几十万倍。超速离心机的出现极大的推动了细胞生物学的研究.
离心技术有二个主要参数，一是离心力，一般用离心机的每分钟转数（r/min)来表示。文献中也经常直接用离心力（g)来表示。离心技术有二个主要参数，一是离心力，一般用离心机的每分钟转数（r/min)来表示。文献中也经常直接用离心力（g)来表示。 二是沉降系数（sedimetation coeffient），它是用来表示大分子沉降速度的，各种大分子颗粒均具有一定的沉降系数。为了纪念诺贝尔奖获得者斯维德伯格，沉降系数的单位用了他的名字命了名，即斯维德伯格单位（Svedberg unit)，简称S。
1、差速离心法（differential centrifugation) 差速离心法是利用不同的离心速度所产生的不同的 离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开， 匀浆液在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心 管底部的速度不同，当离心力不高并且离心 时间不长时，细胞核首先沉到管底。 取出上清液进行离心并加大离心力， 这时可分离出线粒体，这样进行下去不断增大离心力， 最后可分离出核糖体。（原版P168）
如何对分离出的物质进行纯度鉴别呢？一般有两种方法，一种是用电镜作形态学鉴定。更为简便的是利用各种细胞器的特征或特殊酶分子做生化分析。如何对分离出的物质进行纯度鉴别呢？一般有两种方法，一种是用电镜作形态学鉴定。更为简便的是利用各种细胞器的特征或特殊酶分子做生化分析。 2、密度梯度离心法(density gradient centrifugation) 这种方法是利用离心溶液形成梯度来维持重力的稳定性和抑制对流的。这需要在溶液中加入化学惰性物质，如蔗糖、甘油及盐类（如氯化铯、氯化铷）。这些物质不影响分离物的物理及化学性质，分离物的密度一定要在梯度柱密度的范围内，经高速离心后，不同密度的分离物就会集中在等密度带中而得到相互的分离。
密度梯度离心法(density gradient centrifugation) 这种方法是利用离心溶液形成梯度来维持重力的稳定性和抑制对流的。这需要在溶液中加入化学惰性物质，如蔗糖、甘油及盐类（如氯化铯、氯化铷）。这些物质不影响分离物的物理及化学性质，分离物的密度一定要在梯度柱密度的范围内，经高速离心后，不同密度的分离物就会集中在等密度带中而得到相互的分离。
粗糙内质网经分离形成的小泡称微粒体（microsome)，它给内质网的研究带来了极大的方便，正是对微粒体分离研究使我们得到了关于分泌蛋白合成机制等许多成果。又如，在蛋白质合成机制的研究中，当初发现在细胞粗提液中能使RNA翻译成蛋白质。然后将粗提液分步分离，依次得到了核糖体、tRNA和各种酶，是否是这些物质构成了蛋白质合成体系呢？我们可以向这个体系中加入或不加入各种纯组分，这样就可以研究出每个组分在整个过程中发挥准确作用。粗糙内质网经分离形成的小泡称微粒体（microsome)，它给内质网的研究带来了极大的方便，正是对微粒体分离研究使我们得到了关于分泌蛋白合成机制等许多成果。又如，在蛋白质合成机制的研究中，当初发现在细胞粗提液中能使RNA翻译成蛋白质。然后将粗提液分步分离，依次得到了核糖体、tRNA和各种酶，是否是这些物质构成了蛋白质合成体系呢？我们可以向这个体系中加入或不加入各种纯组分，这样就可以研究出每个组分在整个过程中发挥准确作用。
事实上，分离分析法是在构建一种非细胞体系（cell-free system)。这种体系来源于细胞，但不具有完整的细胞结构，它包含了部分细胞提取物，这些提取物能够进行正常的生物学反应。用这种方法使细胞中各种生物学过程相互分开，不受细胞中复杂副反应的干扰，因而可以确定这些生物学过程的
密度梯度离心法(density gradient centrifugation) 是根据检测对象的浮力密度的差异而不是根据他的大小来进行分离的，比如线粒体、溶酶体或过氧化物酶体的大小相近，但密度不同，我们可以根据浮力密度对它们做进一步的分离。这种方法的精确和灵敏是令人信服的，早在1957年人们就用氯化铯密度梯度离心技术将含有15N标记的细菌DNA和未标记的细菌DNA分子分离开，这个经典实验直接证明了DNA的半保留复制。
二 细胞的原位分析方法 人们除了用分离的方法对细胞进行研究外，同时还发展出了一系列对细胞进行原位分析的方法。顾名思义，这种方法要求被测定的物质必须保持在细胞的原来位置不动。一般的细胞化学方法都属于这一类。比如为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，通常利用一些显色剂与被检物质中一些特殊基因特异性相结合，
通过这种结合所产生的颜色的深浅度来判断各种物质在细胞中的分布和含量。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在。通过这种结合所产生的颜色的深浅度来判断各种物质在细胞中的分布和含量。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在。 用氮-汞试剂与组织中蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应,形成红色沉淀。这是著名的米伦(Millon)反应。 原位分析的方法很多，我们在这里仅介绍几种对细胞内核酸和蛋白质进行定位定量分析的方法。
1、孚尔根(Feulgen)反应 1924年德国化学家 孚尔根（Robert Feulgen)在研究核酸时找到了一种方法，它只能使DNA着色，而RNA不着色。他发现DNA在细胞核里，特别是在染色体里。他用此方法证明，DNA普遍存在于动植物细胞核中。 2、原位杂交技术 福尔根技术可使我们了解到DNA在细胞中的存在位置，但如果我们想知道某段特殊核苷酸顺序在染色体上或在细胞中的确切位置，福尔根技术便无能为力了，这需要用原位杂交技术。
2、原位杂交技术 福尔根技术可使我们了解到DNA在细胞中的存在位置，但如果我们想知道某段特殊核苷酸顺序在染色体上或在细胞中的确切位置，福尔根技术便无能为力了，这需要用原位杂交技术。 原位杂交（in situ hybridization)是一项核酸分子杂交技术（nuclear acid molecular hybridization technigue)。其原理是，两条具有互补核苷酸顺序的单链核苷酸分子片断。 在一定条件下通过氢键的结合形成DNA—DNA,DNA—RNA或RNA—RNA双链分子。
1974年Steffensen等从HeLa细胞的多核糖体中分离出5SrRNA，并以125I标记制成探针，并测探出5SrRNA的基因在染色体上的位置。1974年Steffensen等从HeLa细胞的多核糖体中分离出5SrRNA，并以125I标记制成探针，并测探出5SrRNA的基因在染色体上的位置。 具体过程是这样的，首先对载片上的人体细胞中期染色体进行原位变性，并加入探针，这时，探针只能和产生它的模板DNA互补，即进行分子杂交，而其他部位则不行。放射自显影暴露二个月后，发现在所有制片的染色体组中，一对一号染色体均被标记，标记的位置是短臂末端，这说明5SrRNA基因位于第一号染色体的短臂末端。
原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的。原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的。 近年来随着免疫电镜技术的不断进步， 电镜原位杂交技术也得到了发展。 电镜原位杂交和光镜原位杂交的 基本原理是一致的
区别是探针的标记物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或萤光素来标记特异核苷酸序列来制作探针进行原位杂交。然后用与胶体金相连的生物素的特异性抗体对原位杂交样品进行免疫反应，这样就可在电镜下观察到探针的位置。区别是探针的标记物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或萤光素来标记特异核苷酸序列来制作探针进行原位杂交。然后用与胶体金相连的生物素的特异性抗体对原位杂交样品进行免疫反应，这样就可在电镜下观察到探针的位置。
近些年发展起来的免疫细胞化学（immunocytochemistry)开创了这方面研究这项技术主要是利用抗原和其相应的抗体能作特异性结合即免疫反应这一原理，来定位组织或细胞中蛋白质抗原成分的一类技术。近些年发展起来的免疫细胞化学（immunocytochemistry)开创了这方面研究这项技术主要是利用抗原和其相应的抗体能作特异性结合即免疫反应这一原理，来定位组织或细胞中蛋白质抗原成分的一类技术。 我们可以利用这一技术来对蛋白类抗原进行定位定性分析。虽然抗原和抗体的结合具有高度的敏感性和特异性，但是抗体与抗原的结合是看不见的，为了解决这一问题，早在四十年代Coons巧妙的使荧光素和抗体项结合，然后用这种被标记的抗体同被检测的抗原进行免疫反应，这样就很容易在荧光显微镜下检测到组织或细胞中的抗原 。
免疫酶标记技术、免疫铁蛋白技术。特别是1971年Faulk和Taylor创造的免疫胶体金技术。这项技术的特点是，胶体金能迅速而稳定地与蛋白质即抗体相结合，这是一种由于蛋白质被胶体金表面负电荷吸引而结合的过程。这种结合主要是物理过程，不会影响蛋白质的活性，另外金颗粒容易识别，能产生强烈的二次电子，是理想的扫描电镜的标记物。免疫酶标记技术、免疫铁蛋白技术。特别是1971年Faulk和Taylor创造的免疫胶体金技术。这项技术的特点是，胶体金能迅速而稳定地与蛋白质即抗体相结合，这是一种由于蛋白质被胶体金表面负电荷吸引而结合的过程。这种结合主要是物理过程，不会影响蛋白质的活性，另外金颗粒容易识别，能产生强烈的二次电子，是理想的扫描电镜的标记物。
三 细胞动态分析的方法 第一位在这个方向上努力的是德国生物化学家努普（Franz Knoop）。 早在1904年他就用苯环标记脂肪分子对脂肪代谢研究，得出了在体内脂肪代谢过程中脂肪分子每次断裂下两个碳原子的结论。这个结果被40年后的进一步研究所证实。1913年德国化学家帕内斯（Fridrich Adolf Paneth）等人想到了可以用放射性同位素标记生物大分子来研究大分子在细胞中的动态。这样就有了放射自显影技术（radioautograpgy）。
。放射性同位素技术所以能被应用是由于存在两个基本条件，。放射性同位素技术所以能被应用是由于存在两个基本条件， 一是放射性同位素不影响机体的正常代谢。 二是机体细胞对某种元素及其不稳定同位素 “一视同仁”。该项技术的应用使得细胞生物学取得了很大的进展，例如象柠檬酸循环，DNA半保留复制的证明等。 制造带有放射性同位素的小分子并不复杂，只要把普通化合物放在核反应堆里用中子轰击，取出后就带有放射性同位素了。如今用于标记的几乎所有小分子前体都可以通过商品销售得到。
放射自显影术不但在定位研究上有灵敏度高， 定位精确的特点，它还是动态研究中最有效的手段 针对活细胞一般都采用放射自显影的追踪标记 也称脉冲标记(pulse—chase)的方法。 这种方法是先用带同位素标记的前体分子 掺入到生活细胞的代谢中去，标记一段时间 后便把它彻底洗掉，再用不带标记的前体分子代替。 然后在不同时间取样并分析同位素的量和它所在的 位置，从而了解它们的代谢途径。
第三节 细胞培养技术 1885年，德国学者Roux发现鸡胫细胞可在温热的生理盐水中存活一段时间，他称这项试验为 “explanation” ，即体外种植的意思。1907年美国动物学家Harrison从两栖类胚胎中取下一块神经管组织，放在一滴淋巴液中作悬滴培养，他观察到了神经管分化或神经元，并且向培养液中伸出了轴突。这些可以说是细胞培养的开拓性工作。从这些工作可以看出细胞培养(cell culture)是指将细胞从机体中分离出来，进行体外培养的技术。
一 动物细胞培养技术 二种类型，一类是贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞都属这一类型，另一类型是非贴壁依赖性细胞，比如来源于血液，淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞属于这一类型。 贴壁培养 接触抑制(Contact inhibition)。然而接触抑制实际上只抑制了细胞的运动而并没有抑制细胞的分裂。所以我们看到细胞长满生存平面后仍能继续分裂，直到细胞达到一定密度，才停止分裂。这后一种抑制叫密度抑制（Density innibition）。
这时如果要细胞继续分裂增殖就要进行及时的分散，分瓶接种于新鲜培养基中继续培养。这一过程叫传代培养（Subculture）。这时如果要细胞继续分裂增殖就要进行及时的分散，分瓶接种于新鲜培养基中继续培养。这一过程叫传代培养（Subculture）。 这种直接从有机体取出的细胞培养至第一次传代为止，称原代细胞培养。原代培养的细胞一般传到10代左右，大部份细胞才会进入退化期，出现细胞的大量死亡。 有人据此而把培养10代以前的细胞统称为原代细胞培养。
经过10代培养的细胞仍有极少数存， 出现细胞的大量死亡。 有人据此而把培养10代以前的 细胞统称为原代细胞培养。 经过10代培养的细胞仍有极少数存活下来， 这些细胞往往会继续顺利传代40—50次。 虽然这些细胞的形态有了很大的变化， 但它们仍保持着染色体的2倍体数量和接触抑制的行为。 多数学者把这种传代细胞称为细胞株（Cell strain）
细胞传代过程中可能会有极少数细胞发生了带有癌变特点的遗传性突变，发生突变的细胞可能无限制的分裂增殖，这种能无限传代的细胞叫作细胞系（Cell ilne）。
著名的Hela细胞就是1952年从一位名叫Hela的美国妇女的子宫颈上皮癌分离出来的细胞系，目前这一细胞系已遍布世界各地的实验室，但仍没有寿终正寝的迹象。表列出了一些常用的细胞系。 细胞系 细胞来源 3T3 纤维X细胞（小鼠） BHK-21 纤维X细胞（叙利亚XX）
Hela 上皮细胞（人） Vero 肾细胞 CHO 卵巢细胞 PTK1 上皮细胞（袋X）
1． 悬浮培养 非贴壁依赖性细胞如杂交瘤细胞等比较适合于悬浮培养，它是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。这种方法是在微生物发酵的基础上发展起来的。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，它不能耐受剧烈的搅拌和通气。因此在许多方面又与发酵培养不同。 悬浮培养的优点是，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验。它的不足是悬浮培养的细胞密度较低。转化细胞悬浮培养有潜在的致癌危险等。
植物细胞培养 德国植物学家Haberlandt 从1898年开始。 原生质体培养 去壁的植物细胞称原生质体（Protoplast）。原生质体类似动物细胞。它既可供基础理论的研究，也可作应用的研究，其主要方法步骤是：（1）原生质体的制备；（2）原生质体的培养；（3）原生质体培养到细胞培养的过渡；（4）愈伤组织或胫状体的形成；（5）植株再生，（图 鲁润X P12）也可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞的杂交，由此而获得体细胞杂交的植株。
单克隆抗体技术 二十世纪六、七十年代，末尔斯坦（Milstein）等在对抗体深入研究过程中遇到了一个困难，即，要解决抗血清的异质性问题，要求有一个永久抗体产生系，以无限制地提供抗体。而体外培养条件下B淋巴细胞的寿命很短。
事实上自然界中存在能分泌均质的免疫球蛋白又永不死亡的细胞，它是B淋巴肿瘤细胞，它们在浆细胞阶段发生了成瘤转化。这种细胞很容易克隆和体外培养。事实上自然界中存在能分泌均质的免疫球蛋白又永不死亡的细胞，它是B淋巴肿瘤细胞，它们在浆细胞阶段发生了成瘤转化。这种细胞很容易克隆和体外培养。 遗憾的是他们始终没有发现能与B淋巴肿瘤细胞分泌的抗体的相应抗原。因此不能用来进行抗体分析。 1974年末尔斯坦和科勒合作，试图培养一株骨髓瘤细胞，使之能永久产生针对一个已知抗原的抗体。
