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19 双水相萃取

19 双水相萃取. 19.1 双水相的形成. 亲水性的聚合物溶液 熵增 —— 混合 —— 自发 分子间作用力 ------ 随着 Mr 的增加 , 而增大 . 聚合物的不相容性 ------ 含有聚合物分子的溶液发生分相的现象 . 相图 : 相平衡时物系的组成 , 温度与压力的关系. 19.1 双水相的形成. 双水相系统 (aqueous two-phase system, ATPS). PEG = 聚已二醇 (polyethylene glycol). Kpi = 磷酸钾. 1 、 Pro 如何分布 2 、影响因素 3 、应用.

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19 双水相萃取

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Presentation Transcript

  1. 19 双水相萃取

  2. 19.1 双水相的形成 • 亲水性的聚合物溶液 • 熵增——混合——自发 • 分子间作用力------随着Mr的增加,而增大. • 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发生分相的现象. • 相图:相平衡时物系的组成,温度与压力的关系.

  3. 19.1 双水相的形成 双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 1、Pro如何分布 2、影响因素 3、应用 DX = 葡聚糖(dextran)

  4. 19.2 ATPS相图 双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上两点的直线。 系线反映的信息 A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则 B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小. C 临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。

  5. 19.3 蛋白质的分配平衡 1)分配系数m 2)m贡献因子 me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献.

  6. 3)、静电作用 非电解质型溶质:电中性蛋白质的m0： 式中, M: 溶质分子量; : 溶质在上下两相表面自由能的差, J/mol。 意义： A 不受静电作用的影响(因不带电); B 一般 > 0，不同溶质lnm随M而； C ATPS不同, 同一溶质的也就不同，m随ATPS不同而改变。 图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m,

  7. 道南电位(, Donnan potential) 实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两相中m  1), 将两相间产生电位差 带电pro的m: 意义： A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比. B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生的不同,故m与Zpro的关系因盐而异。

  8. 4)疏水作用 相间疏水因子(HF, hydrophobic factor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算: RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity).是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B为: mGly为Gly分配系数. 所以, pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图为测定实例.

  9. Pro表面疏水性(HFS, HF of surface) 利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS 图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得： 其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式

  10. 19.4 影响蛋白质m的综合因素 1)成相聚合物浓度和分子量 分子量M: 若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。 成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相. .

  11. 存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。

  12. 2)盐 ：图为各种离子在PEF/DX系统中的m. 图示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在PEG/DX系统的m小, 因此利用pH > 7的磷酸盐buffer很容易改变,使带负电pro有较高的m. HFS：盐的种类和浓度影响pro的HFS, 从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如>1mol/dm3), 由于强烈的盐析，蛋白质的溶解度达到极限，表现分配系数增大，此时m与pro浓度有关。利用这一特点，通过调节ATPS盐浓度，可选择性萃取不同的pro。 不良影响：改变各相中成相物质的组成和相体积比。如PEG/Kpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。

  13. 3)、pH value A lnm (pH – pI) value pro(Z)

  14. B 交错分配法(cross partitioning): 当加入不同种类的盐时，由于相间电位不同，lnm–pH关系曲线也不一样。但在pro的pI处，由于Z=0，m应相同，即两条关系曲线交于一点。所以, 通过测定不同盐类存在下 lnm–pH曲线的交点,可测定蛋白质\细胞器以及微粒的pI。 C pH影响磷酸盐解离：即影响PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些pro, pH的很小变化会使m改变2~3个数量级。

  15. 4) 温度 温度影响小, 一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用.

  16. 体系的选择和优化 1）体系选择的原则： 基本公式： 根据目标pro和共存杂质的HFS\M\pI\Z等的差别, 综合利用静电、疏水和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。 若目标产物与杂蛋白的表面疏水性HFS相差较大，充分发挥盐析作用；提高成相系统的浓度(系线长度)，增大ATPS的HF，也是选择性萃取的重要手段。

  17. 改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于PEG/盐系统的下相；采用M较大的PEG可降低pro的m，使萃取到PEG相的pro总量减少，从而提高目标蛋白质的选择性。例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系统,可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯12倍,而使用低分子量PEG时,萃取的选择性降低[17].此外,在磷酸盐存在下于pH7的范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性.改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于PEG/盐系统的下相；采用M较大的PEG可降低pro的m，使萃取到PEG相的pro总量减少，从而提高目标蛋白质的选择性。例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系统,可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯12倍,而使用低分子量PEG时,萃取的选择性降低[17].此外,在磷酸盐存在下于pH7的范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性.

  18. 在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统. 双水相萃取放大容易: 一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模. 因此,常利用多组10ml刻度离心管,进行分配平衡实验. 具体实验步骤如下. (1) 配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相, 每个双水相改变一个参数. 其中pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节. (2) 加入料液, 再加水使整个系统质量达到5~10g.离心管封口后充分混合; (3) 在1800~2000g下离心3~5min,使两相完全分离; (4) 小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性, 计算分配系数. 上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。

  19. 19.5应用 1) 蛋白质、酶的纯化 2) 多肽的分离纯化

  20. 3) 核酸的分离纯化

  21. 4)、病毒、细胞、细胞器的分离

  22. 反胶束萃取 （反胶团萃取）

  23. 1 基本术语 胶束(micelles):向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随[S]增大而下降。当[S]达到一定值后，S缔合形成水溶性胶束, 溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。胶团形成均是S分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。 自组装(self-assembly):自动有序聚集的过程 临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC): S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。

  24. 反胶束(reverse micelles): 若向有机溶剂中加入一定浓度S，在有机溶剂中所会形成胶束。当形成反胶束时，水在有机相中的溶解随[S]线性增大。因此，可通过测定有机相中平衡水浓度的变化，确定形成反胶团的最低表面活性剂浓度。 • 反胶束的形态：球形或近似球形，也呈柱状。 • 极性核(polar core): S分子的自组装形成了极性核。 • 微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。

  25. 2 基本性质 内水池直径d：反胶束的大小与溶剂和S的种类与浓度、温度、I等因素有关，一般为5-20nm，d用下式计算： W0-有机相中水与S的摩尔比，又称为含水率(water content)；M-水分子质量；asurf-界面处一个S的面积；N-阿弗加德罗常数。 内水的性质：当W0较低 (如S = AOT, W0 = 6-8)时, 微水相的水分子受S亲水基团的强烈束缚, 表观粘度上升50倍, 疏水性也极高。随W0的增大, 这些现象逐渐减弱, 当 W0>16时, 微水相的水与正常的水接近, 反胶团内可形成双电层。但即使当W0值很大, 水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同, 特别是在接近S亲水头的区域内。

  26. AOT反胶团直径dAOT: 常用于制备反胶束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol OT, 即AOT。其在异辛烷中形成反胶团dAOT: • 第1项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长度. 一般反胶团的W0不超过40. 因此, 依据上式, 利用ATO形成的水核直径一般不超过12nm, 大致可容纳一个直径为5-10nm的pro分子. 当pro分子比与反胶团直径相比大得多时(如,当M > 100-200kD),难于溶解到反胶团中.

  27. 3 反胶束的溶解作用 微水池溶解和分离作用： 反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生物分子提供易于生存的亲水微环境. 因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。

  28. 蛋白质溶解模型： a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开； b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触； c、pro吸附于反胶团内壁； d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。

  29. 3 反胶束的溶解作用 溶解推动力 A 静电作用： 理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中, 左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pH ,即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。

  30. 3 反胶束的溶解作用 B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排阻作用增大, pro溶解下降. 如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图中W0与NaCl浓度关系为: 图还示：AOT/异辛烷系统的含水率与AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性.

  31. 在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取实验研究表明: 随着M增大, pro的分配系数(m, 溶解率)下降。当M > 20KD时, m很小. 表明随M增大, 空间排阻作用增大, pro的溶解率降低. 图的结果还表明, 要据pro间M的差别可以选择性对pro进行萃取分离。 C 疏水性相互作用 aa的疏水性各不相同, 研究表明,除pH和I外, aa或肽的m随aa疏水性的增大而增大[39].蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数. 疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。 D 分配系数m(or K):

  32. 4 反胶束萃取的操作 A 萃取的基本方法 B 反萃取 . C 分级萃取

  33. 5 反胶束萃取的影响因素 1) pH value AOT = 二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。

  34. W0 2)盐浓度 盐浓度 选择性 S&Pro Z

  35. 3)、盐离子的种类

  36. 4) 蛋白质分子量M

  37. 5)、表面活性剂S A 种类 B [S]

  38. 6) 助表面活性剂

  39. 6 应用 1) 蛋白质分离

  40. 6 应用 2) 胞内酶的提取 3) 蛋白质复性( protein refolding )

  41. 思考题

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