IDB HC3 en HC4

1. IDB HC3 en HC4 Enzymen en enzymkinetiek Michaelis Menten Inhibitie van enzymen Ivo Horn

2. Te bestuderen • Wilson and Walker, Principlesandtechniques of biochemistry andmolecularbiology: blz 581-588 • Campbell andFarrell, 7e editie: H6, 6.1-6.7 optioneel: • Campbell andReece, 9e editie: H8: 8.4

3. Biologische katalyse • Katalyse is de belangrijkste functie van eiwitten • Katalyse: versnellen/efficienter laten verlopen van een reactie • Biologische katalytische eiwitten: enzymen • Verhogen de snelheid 1020. niet-enzymen komen tot 104 • Er zijn enkele niet-eiwit katalytische biomoleculen: ribozymen. Dit zijn katalytische RNA’s

4. Biologische wasmiddelen • Bevatten enzymen • Unilever research • Hittebestendig maken van eiwitten! • Normale enzymen werken optimaal bij 37 graden Celsius

5. Een enzym betrokken bij ziekten • Het GTPase Ras is een enzym • Zet GTP in GDP om • Verandert daarbij van conformatie/vorm • De GTP –gebonden vorm is aktief en geeft signalen door in de cel • In bijvoorbeeld bepaalde tumoren is Ras gemuteerd en constant in de aktieveconformatie

6. Acetylcholine esterase (ACE) Bij Alzheimer: het enzym acetylcholine esterase wordt geremd waardoor afbraak van acetylcholine tegen wordt gegaan

7. Functies van eiwitten: • Enzymen: versnellen reacties • Structurele eiwitten: collageen (in bot) en keratine (in haar) • Opslag eiwitten: albumine (in bloed) en caseïne (in melk) • Transport eiwitten: Hb (O2 in bloed), albumine (bili in bloed) • Hormonale eiwitten: insuline, glucagon • Receptor eiwitten • Contractiele eiwitten in spierweefsel • Defensieve eiwitten: antilichamen

8. PKMζ

9. Indeling van enzymen: • Transferases (verplaatsengroepen op eiwitten) • Hydrolases (maken water vrij) • Ligases (“lijmen” DNA stukkenaanelkaar) • Kinases (fosforylereneiwitten) • GTPases (zetten GTP om in GDP) • Fosforylases (verwijderenfosfaatgroepen) • etc

10. geheugenfunctie • PKMζ is betrokken bij geheugenvorming • Muizen kregen saccharine toegediend • Misselijkheid werd opgewekt direct daarna • Reactie later op saccharine: misselijkheid (geheugen!) • Injectie ZIP in de cortex, geen misselijkheid. Remming enzym PKMζ

11. Voorbeeld groep 1 CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH+ H+ ethanolethanal Alcoholdehydrogenase (alcohol:NADoxidoreductase) Nummer 1.1.1.1 (EC-rules) 1.Hoofdgroep 1.CH-OH is donor 1.NAD+ of NADP+ is acceptor 1.Eerst gevondenenzym in dezegroep Verwijdertprotonen en vormtdaardoorethanaluit ethanol

12. Overzicht • Katalytisch vermogen,specificiteit, regulatie • Introductie enzymkinetiek • Kinetiek van enzym-gekatalyseerde reacties • Enzyminhibitie • Ribozymen

13. Enzymen • Enzymen laten cellen beschikken over het vermogen om reacties zo snel te laten verlopen als nodig is voor de cel • Enzymen zijn de stoffen die gerelateerd zijn aan een metabolische functie

14. Gekatalyseerde reacties vergen minder activatie energie

15. De DG waarde • Negatief: exergone reactie. Spontaan verlopende reactie; er komt energie vrij • Positief: endergone reactie. Reactie vraagt energie om te verlopen. Energetisch dus ongunstig • Nul: exergoon noch endergoon. Evenwicht situatie

16. De Gibbs vrije energie, DG • DG = Gproducten – G reactanten • DG is onafhankelijk van de gekozen route • DG zegt niets over de snelheid van de reactie • Indien negatief: dan kan de reactie plaats vinden. Dat wil niet zeggen dat het merkbaar of snel gebeurt!

17. Relatie tussen vrije energie en evenwichtsconstante K • DG = DG0 + RT ln K • K is quotiënt van de concentraties reactanten • K = [AB]/[A][B] • R is de gasconstante • DG0 is de standaard vrije energie (vaste waarde)

18. Allosterische enzymen: sigmoidale curve

19. Allosterische enzymen • Binden een bepaald molecule • Veranderen dan van vorm • Kunnen nu efficiënt aan substraat binden • Hemoglobine kent een allosterisch effect door zuurstof binding

20. Gekoppelde enzymatische reacties

21. Co-factoren, co-enzymen en prostetische groep • Veel enzymen hebben andere verbindingen nodig • Zijn klein t.o.v. het eiwit • Anorganisch: Co-factor • Organisch: • Covalent: prostetische groep • Niet-covalent: co-enzym (vaak afgeleid van vitamines)

22. Prosthetische groepen en cofactoren: zijn nodig voor enzymatische activiteit

23. Katalytisch vermogen • Enzymenkunnenreactiesversnellen tot 1016 x zosnelalsniet-gekatalyseerdereacties! • Urease is eengoedvoorbeeld: • gekatalyseerd: 3x104/sec • Nietgekatalyseerd: 3x10-10/sec • Ratio is 1x1014 !

24. Specificiteit • Enzymenherkennenhunsubstraat (substraat-specificiteit) • Enzymenlevereneenopbrengst van meerdan 95% (reactiespecificiteit) • Specificiteitwordtbepaald door de unieke“fit”tussen het substraat en het enzym

25. Enzymatischemodellen

26. De cyclus van een enzym

27. Enzymatische werking

28. Schematisch de werking van een enzym

29. Eenvoorbeeld van eenenzym

30. Wat enzymen doen.... • Enzymenversnellenreacties door verlaging van de activeringsenergie • Enzymendoendit door de “transition state” van de reactiebetertebindendan het substraat

31. enzymreacties Foutje in tekstboek: DP is niet negatief, want wordt gevormd!

32. Enzymreacties k1 k2 E + S  ES  E + P k-1 E is enzym S is substraat ES is het complex van E en S P is product k zijn snelheidsconstantes K is (k-1 + k2) / k1

33. Verzadiging Bij kleine hoeveelheid enzym t.o.v. substraat Enzym op maximale snelheid Enzym kan niet sneller omzetten Verzadiging van het enzym

34. Reactiesnelheid is afhankelijk van de concentratie substraat

35. Bij hoge S concentraties nadert v de Vmax waarde

36. Michaelis - Menten Leonor Michaelis Maud Menten

37. Michaelis Menten kinetiek • De basis voor de meeste niet-allosterischeenzym-reacties • Ontwikkeld in 1913 • Karakteriseert enzym-activiteit in termen van snelheid en binding aan het substraat

38. Reactieschema k1 k2E + S  ES  E + P k-1

39. Michaelis-Menten vergelijking Michaelis-Menten's theorie • Gaat uit van de vorming van een enzymsubstraatcomplex • ES is in een snel evenwicht met E en S • De reactie van ES naar E en P gaat langzaam

40. Eerste orde kinetiek: er is een lineair verband tussen enzymatische snelheid en substraat concentratie

41. snelheid vorming ES = k1.[E].[S] snelheid van afbraak van ES = (k-1+k2).[ES] a Km = [E].[S] = (k-1+k2)/k1 [ES] Km = Michaelis-Menten constante Michaelis-Menten mechanisme

42. Michaelis-Menten– vergelijking:Vmax.[S] v = ---------------- Km + [S]

43. De Vmax • Vmax is een“constante” • Vmaxis de theoretischmaximalesnelheid van de reactie • Vmaxvereistdatalleenzymmoleculenaan het substraatgebondenzijn • Vmaxwordtbenaderdals de substraatconcentratiehoog is

44. De steady state • Er is weinig enzym-substraat complex aanwezig • Complex vorming en afbraak zijn in evenwicht • Enzymen bereiken snel de steady state fase: zijn efficiënt in het katalyseren van de reactie

45. Het turnover getal Eenmaatvoor de katalytischeactiviteit • is het aantalsubstraatmoleculenomgezet in product per enzymmolecuul per sec, alshet enzym (E) is verzadigd met substraat. • k2 = kcat = Vmax/[Et] • kcatvarieert per enzym (minder dan1/sec tot velemiljoenen/sec

46. Enzymen beschrijven we middels kcat en Km

47. De Michaelisconstante Km • Km is eenconstantewaarbij de Vmax half-maximaal is • Km is afgeleid van de reactiesnelheid-constanten • KleineKm: sterke binding; hoge Km: zwakke binding

48. Bepaling Km

49. Lineaire Plot van Michaelis-Mentenvergelijking V0 = Vmax.[S]/(KM + [S]) Lineweaver-Burk: zet in reciproke vorm 1/V0 = (KM/Vmax).1/[S] + 1/Vmax Vergelijk met : y = a.x + b

50. Door de Michaelis Menten curve lineair te maken zijn Km en Vmax eenvoudig te bepalen Lineweaver-Burk-plot