Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ

1. Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло - и изоплазматические линии растений Соматические гибриды у растений и животных Генетическая трансформация клеточных органелл Биотехнологические задачи и трансформация пластома Внутриклеточное перераспределение генов Инвертированная генетика.

2. Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер Все известные подходы к созданию ядерно-цитоплазматических химер можно условно разделить на три группы: Моделирование на уровне отдельных гибридных клеток и регенерантов, полученных из них Моделирование на уровне организма Моделирование на уровне геномов органелл Транспластомные томаты

3. а x В А b a b AB AB Моделирование на уровне организма реципрокные гибриды изоплазматические линии аллоплазматические линии b x A B a Реципрокные гибриды А(а) х В(в) = АВ (а) В(в) х А(а) = АВ (в)

4. Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно Генетические различия между эндоспермами могут вызывать различия в развитии растений, особенно на ранних стадиях их онтогенеза Как у растений, так и у животных яйцеклетка, несущая значительный запас различных биосинтетических компонентов (в том числе долгоживущих матричных РНК), может предопределять особенности развития организма. Этот материнский эффект обусловлен ядерными генами яйцеклетки, а не различием по органельным генам двух родителей

5. Моделирование на уровне организма В В b b a AB Межвидовые скрещиванияВнутривидовые скрещивания а а x В x А А b a x x В b AB 6-10 поколений насыщающих скрещиваний 6-10 поколений насыщающих скрещиваний a a B B аллоплазматические линии изоплазматическиелинии

6. Геномы аллолиний Белки органелл аллолиний ♀ многократное беккроссирование ♂ A B многократное беккроссирование х мт мт ♀ ♂ B A хп хп х B мт мт А Аллолиния В(А) A хп хп ♀ A(мтa хпa ) х ♂B (мтb хпb )→B(мтa хпa ) “B+A” B “А” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК органелл “В” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК ядра Аллолиния В(А) “B+A” ♀ A(мтA хпA ) х ♂B (мтB хпB) → B(мтB+AхпB+A) • . • Схема наследования ДНК органеллами при создании аллолиний путем беккроссирования (при условии строго материнского наследования органелл). А – материнское растение, В – опылитель, В(А) – аллолиния, имеющая генотип ядра В (опылителя) и геномы органелл А (исходного материнского растения). • Белки органелл аллолиний кодируются как ядром В (линии-опылителя) (бóльшая часть), так и собственными геномами органелл А (не более 1% всех белков, входящих в состав органелл).

7. Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий создана на пшенице В 1951 годуяпонский генетик Kихара создал первую серию аллоплазматических линий Донор ядра, мягкая пшеница Донор цитоплазмы, дикий злак Aegilops ovata Triticum aestivum Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552комбинации

8. Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum vulgare и цитоплазматические геномы 12 форм дикого, полукультурного и культурного ячменя (H. vulgare и H. spontaneum) – всего 84 ядерно-плазменные комбинации, была создана в нашей лаборатории И.М.Голоенко под руководством О.Г.Давыденко экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки фертильность Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний фотосинтетические и респираторныепараметры            устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам морфогенетические потенции конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома

9. Моделирование на уровне клетки Гибридизация неполовых клеток растений – второй способ получения ядерно-цитоплазматических химер – впервые была выполнена в 1972 г. В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах Solanum Nicotiana Petunia цибриды Brassica Glycine Arabidopsis Daucus Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ?

10. S. commersonii S. tuberosum Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного, так и другого родителя Если пластиды одного вида чем-то повреждены + S.tuberosum+S.commersonii 6 растений с пластидами S. tuberosum 8 растений с пластидами S. commersonii Не удалось обнаружить гибрид, сочетающий пластиды S. tuberosum и митохондрии S. commersonii P. hybrida + N. tabacum Митохондрии P.hybrida несовместимы с ядром N.tabacum N. tabacum – ядро ~" N. tabacum "митохондрии P.hybrida- пластиды N. tabacum – ядро N. tabacumмитохондрии P.hybrida- пластиды Цибрид жизнеспособный Цибрид аномальный (митохондриальная ДНК рекомбинантная)

11. S. commersonii S. tuberosum При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны Гербицид SAN 9789 вызывает обесцвечивание пластид + Все растения с пластидами S. commersonii S.tuberosum + S.commersonii растения с пластидами S. tuberosum

12. Как ведут себя органеллы у цибридов? Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений Получены цибриды: внутривидовые, межвидовые межродовыеNicotiana tabacum +Petunia hybrida межтрибные N. tabacum (Я) +Salpiglossis sinuate (ХП)+ МТ рекомбинантного типа Попытка создать межсемейственный цибрид Solanum nigrum +N. tabacum успехом не увенчались

13. До завершения сегрегацииорганелл в клетках соматических гибридов присутствуют пластиды и митохондрии обоих родителей Что происходит с их геномами в этот период? Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК

14. Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений первые спонтанно слившиеся клетки обнаружены Barskiи сотрудниками еще в 1960 году, а в середине 60-х годов получены первые искусственные межвидовые гибриды

15. Энуклеация ооцита -микроманипуляция При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация митохондриальных ДНК, которая в клеточных гибридах мыши и человека происходит с высокой частотой

16. Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана уже в ранних работах Была найдена корреляция между утратой хромосом одного из родителей гибрида и соответствующей сегрегациейего митохондриальной ДНК При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей

17. Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь Bos indicus Многократное спаривание Bos taurus Американские коровы европейского происхождения Быки из Индии Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus При экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы,мтДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала мтДНК ооцита хозяина

18. Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and Rattus norvegicus L. Предварительная энуклеация ооцит мыши Перенос ядра крысы Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток Развитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток ооцит мыши Перенос ядра крысы Развитие цибрида идет до стадии морулы Перенос цитоплазмы крысы ооцит мыши Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши

19. Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды Ядро Bosindicus Митохондрии гориллы Митохондрии гориллы Ядро человека Митохондрии шимпанзе МитохондрииBosindicus + Bos taurus При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК)

20. Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus, неясна; предполагают, что это результат различий в скорости репликации органелл. В эксперименте тех же авторов на гибридной линии мышей наблюдалась стабильная гетероплазмия по мтДНК до 15-го поколения гибридных клеток. ИТАК, попытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия

21. Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных генов в геномы органелл) Вехи разработки метода генетической трансформации 60-ые годы – генетическая трансформация ядра. 1984 – перенос в Е.coliиB.subtilisпластидного rbcLгена и его экспрессия 1987 – разработка метода биолистической трансформации 1988 - трансформация пластид Chlamydomonas и митохондрий дрожжей 1990 - трансформация пластид Nicotiana tabacum (3 из 150 обстрелянных растений)

22. Первая трансформация Chlamydomonas Обстрел частицами, несущими немутантный аналог гена Восстанавливается нарушенный фотосинтез Мутант по гену atpB Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

23. Что нужно для успешной трансформации пластид? Метод переносагена через мембрану клетки и двойную мембрану пластид Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию

24. 1987 г. - разработан метод «биолистической» трансформации включающего биологические и баллистическиеприемы Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы

25. Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно двойные мутанты устойчивости к антибиотикам, так как частота спонтанного мутирования пластома достаточно велика Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS+ вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК. Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al.,

26. Пластидная ДНК Ген А ген Вген С ген D ген В ген T aadA ген С Трансформационный вектор При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома A Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации Плазмида встраивается в пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде B Пластидная ДНК после трансформации Ген А ген Вген Т aadAген С генD ген В ген С Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом

27. Как удается встроить в пластом чужеродные гены? Успешной трансформации можно добиться при встраивании гетерологичных последовательностей, если фланкировать их гомологичными ДНК фрагментами Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н

28. Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных? 1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка. Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах. 2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь. 3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена 4. При трансформации ядерных генов у растений нередко низкий уровень экспрессии трансгенов связан с массой эпигенетических эффектов или механизмом «генного безмолвия» (gene silencing), в пластидах этого не происходит. 5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?)

29. Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных растений: Встраивание гена Btв хлоропластный геном табака Экспрессия гена токсина Bacillus thuringiensis в растениях табака: Bt токсин составлял 3-5% от общего растворимого белка клетки Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах образовывались кристаллы белка-токсина !!! Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев

30. Еще один пример: наработка транспластомными растениями гормона роста человека - соматотропина Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру Количество гормона достигало до 7% от общего растворимого белка клетки Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет

31. Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах(хромопласты) В перспективе: “plantibodies” Съедобные вакцины Антитела и другие фармакопрепараты Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica

32. ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ Впервые искусственная замена митохондриальной копии гена на ядерную была выполнена на мутантных клетках дрожжей без ATP8 Гены трех субъединиц ATP(6,8,9)у дрожжей находятся в митохондриях у нейроспоры ген субъединицы 9 переместился в ядро Scwt TpN-atp9 atp6 atp8 atp6 atp8 atp9 N m N9/Y8 pLF1 N m TpN-atp8art Sc mit - Sctr atp6 atp9 atp6 atp9 TpN-atp8art Последовательность синтезирована химическим путемin vitro N m N m

33. Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3 Последствия инактивации гена ycf3

35. Области исследования и практического применения нехромосомной наследственности для улучшения растений