TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS Verónica Fernández Mancebo 2013

1. TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS Verónica Fernández Mancebo 2013

2. TRANSCRIPCIÓN: • Es la síntesis de una cadena de ARN • Representa a una de las hebras de ADN (hebra codificante) • y es complementaria a la que le sirvió como molde

3. Diferencias para recordar

4. Repasando… CROMATINA Complejo de ADN-proteínas Proteínas -> histonas (peq ricas en K y R) ->no-histonas (polimerasas, factores de transcr, etc.) Nucleosoma Unidad estructural repetida que forma la cromatina (146pb que envuelve un octámero de histomas)

5. Los nucleosomas se conectan por espaciadores de ADN que se llaman ADN de unión o internucleosoma Los nucleosomas compactan el ADN eucariota, en varias veces su tamaño, permitiendo que quepa en el núcleo del al células Heterocromatina Eucromatina (transcripción)

6. Síntesis de ARN en eucariotas: • ARN polimerasas (I, II y III) • Utiliza promotores y tiene un importante uso de “enhancers” (potenciadores) • Factores de transcripción (interaccionan con ADN y otros factores) • Poca regulación en el punto de terminación • Los ARN transcriptos primarios son ampliamente procesados

7. Unidad de transcripción Promotor 5’ 3’ 3’ 5’ -1 +1(Inr) upstream (-) downstream (+) La síntesis comienza cuando la ARN-polimerasa se ubica en el punto de inicio (Inr) EXPRESIÓN ARN transcripto primario ADN ARN maduro transcripción Procesamiento

8. ARN pol II ARN pol I ARN pol III En eucariotas existen 3 ARN-polimerasas nucleares

9. Punto de inicio –170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20 Upstream control element Core promoter UBF1 UBF1 SL1 TBP TBP ? Pol I ARN polimerasa I • Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) • Está formada por 13 subunidades • Necesita la acción de 2 elementos de control (UCE y Core) Existen muchas (cientos) copias de la unidad de transcripción (todos el mismo promotor) • Sintetiza el 80-90% del ARN total de una célula • Produce un único ARN transcripto primario

10. Procesamiento del pre-rRNA • Los cortes son en lugares específicos en una secuencia específica • Parece estar ayudada/catalizada por ARN pequeños nucleolares (snoARNs). • snoRNAs se asocian a proteínas (snoRNP) (ej. fibrillarina) • Metilaciones (Met): • Sufre varias metilaciones Por ej 18S: 4Met • Posiciones conservadas de los metilos (en determinadas ribosas). 5S: sintetizado por ARNpol-III (nucleoplasma) no sufre modificaciones migra hacia el nucleolo para ensamblarse

11. Punto de inicio 5’ Oct PSE TATA 3’ Tipo 1 A C Tipo 2 A B ARN polimerasa III • Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) (nucleoplasma) • Está formado por 14 subunidades • Es la polimerasa con menor producción de ARN • Los promotores pueden estar tanto en la región 5’ (snARN) como 3’ (5S y tARN) • Los internos: tipo 1 y 2

12. Punto de inicio Punto de inicio Requiere de varios tipos de factores como TFIII-A, TFIII-B y TFIII-C TIPO 2 (ejalgtARN) TIPO 1 (ej 5S) A B A C TFIIIC TFIIIC TFIIIA TFIIIC TBP TBP TFIIIB TFIIIB TFIIIB Pol III Pol III TFIIIB

13. Procesamiento del pre-tRNA (ARN pol III) Intrones *Una endonucleasa corta en los extremos. Se producen dos medias-moléculas de tRNA [5’OH y 3’PO4 cíclico (2’-3’)] *La reacción de la ligasa de tARN, tiene lugar en tres pasos: a)Fosforilacióndel 5’OH con el gamma-PO4 del GTP. b)Formación de un intermediario activado de la ligasa (ligasa-AMP) que transfiere el AMP cíclico al 5’PO4 del sustrato. c)El PO4 cíclico se abre dando 2’PO4 y 3’OH. Se da la formación del 5’-3’-fosfodiester y el AMP cíclico se libera. *La fosfotransferasa dependiente de NAD (nicotinamidaadeninadinucleótido) transfiere el 2’PO4 al NAD

14. Extremo 5’: endonucleasaribonucleasa P (RNasa P) (enzima-RNP) Extremo 3’: Cambio de U del extremo por CCA (3’ ) Codón de Tyr 5’-UAC-3’ Anticodón 5’-GUA-3’ • Agregado de grupos metilos e isopentilos a residuos de purinas • Metilación de los 2’OH de la ribosa • Conversión de U a residuos de dihidro-U (D), pseudo-U (Ψ) o ribotimidinas (T, metiluridinas)

15. ARN POLIMERASA II • Transcribe los genes estructurales (prot) a ARNm (y hnARN) (nucleoplasma). Es la enzima que transcribe la más diversa población de ARNs. • Múltiples subunidades • Se observan 3 grupos de promotores: genéricos, específicose inducibles. • Promotores genéricos: secuencia mínima necesaria con la cual la polimerasa puede iniciar la transcripción. No depende de secuencias reguladas por tejidos. Son de baja eficiencia • Al menos 8 factores de transcripción (TFII A,B,C,D,E,F,H,J) • Condiciones generales para la síntesis de ARN • Inr (región iniciadora) puede ser descrita como Py2CAPy5 • TATA box: secuencia consenso de 8pb a unos ~25pb, rodeado de secuencias ricas en GC. Lo contienen la gran mayoría de los promotores. Se une TFIID/TBP • TAF: TBP-associatedfactors

16. TFIIH TFIIJ TFIIA TBP TFIIB Punto de inicio P P P P P P TFIIE P [YSPTSPS]n TATA TFAs ARN Polimerasa II TFIIF

17. Las proteínas del potenciador se unen a las del promotor induciendo la transcripción

18. Procesamiento del pre-mARN

19. La caperuza • Implica una condensación de un grupo trifosfato y varias metilaciones. • Juega un importante papel en la iniciación de la síntesis de la proteína • Protege al ARNm de la degración mientras se está sintetizando el transcripto • Involucrado en exportación ARNm al citoplasma

20. CAP cap0 GTP-Met + * + pp + p cap1 cap2

21. La cola de poli(A) • Da estabilidad al ARNm en el citoplasma • Colabora con la exportación del ARNm • Está implicada en la traducción • Consecuencia práctica (purificación) • Excepción: las histonas

22. Complejo actuante: CPSF, CstF, CF (I yII), PAP y PABP.

23. Remoción de los intrones (corte-empalme o “Splicing”) • Las reacciones son por transesterificación • La remoción de los intrones no es secuencial. • Involucra partículas de snRNP y otros factores independientes Formación del “spliceosoma”

24. U1: ARN pequeño nuclear (snARN) que forma parte de la partícula snRNP U1, que reconoce el sitio donante (sitio 5’ de “splicing”)

25. “Splicing” alternativo • Un solo ADN que utiliza diferentes puntos de inicio y finalización de la transcripción, alterando el patrón de “splicing” • Existe un solo transcripto de ARN que es empalmado de más de una manera. Los exones son sustituidos, agregados o ignorados.

26. “Splicing” alternativo Diferenciación sexual en Drosophila La diferenciación sexual en la mosca de la fruta, está regulada por una proteína llamada“sex-lethal”(sxl).  El embrión hembra expresa la proteína Sxl funcional mientras que en los embriones machos expresan una proteína Sxl no-funcional.

27. “Trans-splicing” - Agregado de SL • *La secuencia lider (SL) provee un exon extra en el 5’ del transcripto • *Es el mismo mecanismo que en el cis-splicingpor transesterificación (pero se genera una molécula de ARN con forma de “Y”) • *Esencial en Trypanosoma • La región que codifica para la SL es muy parecida al U1 (que falta) • Cap 4 (2,2,7-trimetil guanosina y están metiladoslos 4 ntssgtes) • *Trans-splicingalternativo (LYT1: nuclear y secretada)

28. Ejemplo en mamíferos con la proteína ApoB. “Editado” del ARNm • No hay evidencia que exista otro gen u otro exón • Aparentemente el cambio ocurre por una desaminación (C U), por lo que podría estar involucrada una citosinadesaminasa

29. Editado usando ARN guías Mecanismo Esencial para Trypanosomátidos

31. Resumen: • ARN polimerasas y esquema de sus promotores • Procesamiento de los pre-ARNr • Modificaciones en los pre-ARNt • Maduración de los pre-ARNm: • Cap • poli(A) • cissplicing(simple, alternativo) • transsplicing • Editado • Esquema de los controles en la expresión génica

32. ¿Preguntas? ¿Dudas?