460 likes | 692 Vues
Oversikt over kap.10. Utfordringer og strategier ved genomanalyseGenomst?rrelseEgenskaper m? ogs? analyseresProblemer med DNA polymorfismerUtvikling av hel-genom kartInnsikt kommer fra fullstendig genomsekvenseringAntall og type generGrad av repeterte sekvenserGenom organisering og struktur
E N D
1. Kap 10.Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylr analyse
2. Oversikt over kap.10 Utfordringer og strategier ved genomanalyse
Genomstrrelse
Egenskaper m ogs analyseres
Problemer med DNA polymorfismer
Utvikling av hel-genom kart
Innsikt kommer fra fullstendig genomsekvensering
Antall og type gener
Grad av repeterte sekvenser
Genom organisering og struktur
Evolusjon og lateral genoverfring
Hyeffektive verkty for analysere genomer og deres proteinprodukter
DNA sekvensatorer
DNA arrays (mikromatriser)
Massespektrofotometere
3. Genomene til levende organismer varierer enormt i strrelse
4. Genomikere ser p to hovedtrekk ved genomer: sekvens og polymorfisme Hovedutfordring bestemme sekvensen til hvert kromosom i genomet og identifisere mange polymorfismer
Hvordan kan man sekvensere et 500 Mb kromosom med 600 bp p en gang?
Hvor nyaktig skal en genomsekvens vre?
DNA sekvenseringsfeil er p omkring 1% per 600 bp
Hvordan kan en skille sekvensfeil fra polymorfismer?
Forekomst av polymorfismer i diploide humane genomer er omkring 1 av 500 bp
Gjentatte sekvenser kan vre vanskelige plassere
Uklonbart DNA kan ikke sekvenseres
Opp til 30% av genomet er heterokromatisk DNA som ikke kan klones
5. Splitt og overvinn strategien imtekommer de fleste utfordringer Kromosomer blir brutt ned i sm overlappende biter og klonet
Endene til klonene blir sekvensert og satt sammen til de opprinnelige kromosomtrdene
Hvert stykke blir sekvensert mange ganger for redusere feilmarginen
10-gangers sekvensdekning gir en feilmargin p mindre enn1/10 000
6. Figure 10.2Figure 10.2
7. Teknikker for kartlegging og kloning Kloning
Bibliotek med DNA fragmenter p 500 1,000,000 bp
Innskudd inn i diverse vektorer
Hybridisering
Lokalisering av spesielle DNA sekvenser innen biblioteket av fragmenter
PCR oppformering
Direkte oppformering av et spesielt omrde som spenner over fra 1 bp to > 20kb
DNA sekvensering
Automatisert DNA sekvensering som bruker Sanger metoden, bestemmer sekvenser p opptil 600 bp p en gang
Dataassistert verkty
Programmer for identifisere sammentreff mellom en spesiell sekvens og en stor populasjon av tidligere sekvenserte fragmenter
Programmer for identifisere overlapp av DNA fragmenter
Programmer fro estimere feilmargin
Programmer for identifisere gener i kromosomale sekvenser
8. Lage storskala koblingskart Typer av DNA polymorfismer brukt til storskala kartlegging
Single nukleotide polymorfismer (SNPs) 1/500 1/1000 bp gjennom genomet
Enkle (Simple) sekvens repetisjoner (SSRs) 1/20-1/40 kb gjennom genomet
2-5 nukleotides blir repetert 4-50 eller flere ganger
De fleste SNP'er og SSR'er har liten eller ingen effekt p organismen
Fungerer som DNA markrer gjennom kromosomene
M vre i stand til raskt identifisere og analysere populasjoner fra 100vis til 1000vis av individer Figure 10.3Figure 10.3
9. Genetiske markrer identifiserer hele genomer De frste genetiske kart brukte SSR'er som er hyt polymorfe
Identifisert ved screening av DNA biblioteker med SSR prober
Oppformert ved PCR og lengde- forskjeller analysert
SNP'er millioner flere i det siste identifisert ved sammenligning av ortologe omrder av cDNA kloner fra ulike individer
10. Homologer gener med tilstrekkelig sekvenslikhet til vre beslektet til en viss grad i evolusjonshistorien
Ortologer gener i to forskjellige arter som oppsto fra det samme genet i de to artenes felles stamfar
Paraloger oppsto ved duplisering innen sammen art
Ortologe gener er alltid homologe, men homologe gener er ikke alltid ortologe
11. SNPer og SSRer ved genom dekning Inntil nylig ble kart konstruert fra omkring 500 SSRer jevnt spredd tvers gjennom genomet (1 SSR for hver 6 Mb)
SNPer gir mer enn 500,000 DNA markrer tvers gjennom genomet
12. Typing av genetiske markrer over hele Genomet To trinns analyse for enkle sekvens repetisjoner
PCR oppformering
Strrelses separasjon Figure 10.4Figure 10.4
13. Langtrekkende fysiske kart: karyotyper og genomiske bibliotek posisjonerer markrer p kromosomene Fysiske kart
Overlappende DNA fragmenter ordnet og orientert over hele spennet av kromosomene
Basert p direkte analyse av DNA istedet for rekombinasjon som koblingskart er basert p
Kartlegger virkelig antall bp, kb, eller Mb som skiller et lokus fra sine naboer
Koblings- kontra fysiske kart
1 cM = 1 Mb i mennesker
1 cM = 2 Mb i mus
14. Vektorer brukt til klone store inskudd til fysisk kartlegging YACer (yeast artificial chromosomes)
Innskudd strrelse 100-1,000,000 Mb
BACer (bacterial artificial chromosomes)
Innskudd strrelse 50 300 kb
Mer stabile og lettere rense fra verts DNA enn YACer
15. Hvordan bestemme rekkeflgen av kloner gjennom genomet Overlappende innskudd hjelper til med sette sammen klonede fragmenter
Ovenfra og ned tilnrming innskudd blir hybridisert mot karyotype av hele genomet
Nedenfra og opp tilnrming overlappende sekvenser av titusenvis av kloner bestemmes ved restriksjonsseteanalyse eller sekvens- merkede (tag) seter (STSer)
16. Human Karyotype (a) Fullstendig sett med humane kromosomer farget med Giemsa fargestoff viser bnd
(b) Ideogrammer viser idealiserte bndmnstre Figure 10.5 aFigure 10.5 a
17. Kromosom 7 ved tre opplsningsniver Figure 10.5 bFigure 10.5 b
18. FISH protokoll for ovenfra og ned tilnrming Figure 10.6Figure 10.6
19. DNA hybridisering og restriksjonskartlegging en nedenfra og opp tilnrming Figure 10.7Figure 10.7
20. Identifisering og isolering av ett sett med overlappende fragmenter fra et bibliotek To tilnrminger
Koblingskart brukes til utvikle fysiske kart
Sett av markrer mindre enn1 cM fra hverandre
Bruk markrer til gjenfinne fragmenter fra biblioteker ved hybridisering
Konstruer kontiger to eller flere delvis overlappende klonede fragmenter
Kromosomvandring ved bruke ender av usammenhengende kontiger til probe fragmenter i ukartlagte omrder
Fysiske kartleggingsteknikker
Direkte analyse av DNA
Overlappende kloner settes sammen ved restriksjonskartlegging
Sekvens merkede (tagged) segmenter (STSer)
21. Hyopplselig koblings kartlegging til bygge overlappende sett av genomiske kloner Figure 10.8Figure 10.8
22. Fysisk kartlegging av overlappende genomiske kloner uten koblingsinformasjon Figure 10.10Figure 10.10
23. Fysisk kartlegging ved analyse av STSer Figure 10.11Figure 10.11
24. Sekvenskart viser rekkeflgen av nukleotider i et klonet stykke DNA To strategier for sekvensere det humane genom
Hierarkisk shotgun tilnrming
Hel-genom shotgun tilnrming
Shotgun tilfeldig genererte overlappende innskutte fraagmenter
Fragmenter fra BACer
Fragmenter fra oppkutting av hele genomet
Oppkutting av DNA ved sonikering
Delvis fordying med restriksjonsensymer
25. Hierarkisk shotgun strategiBrukt av den offentlig stttede innsats for sekvensere det humane genom Kutt 200 kb BAC kloner i ~2 kb fragmenter
Sekvenser endene 10 ganger
Ndvendig med omkring 1700 plasmid innskudd per BAC og omkring 20,000 BACer for dekke genomet
Data fra kobling og fysiske kart brukes til sette sammen sekvenskart av kromosomene
Betydelig arbeid i lage bibliotek av hver BAC og fysisk kartlegge BAC kloner Figure 10.12Figure 10.12
26. Hel-genom shotgun sekvenseringBrukt av det private firma Celera til sekvensere hele det humane genom Hel-genom tilfeldig kuttet tre ganger
Plasmid bibliotek konstruert med ~ 2kb innskudd
Plasmid bibliotek ~10 kb innskudd
BAC lbibliotek med ~ 200 kb innskudd
Dataprogram setter sammen sekvenser inn i kromosomer
Ingen fysisk kartkonstuering
Bare et BAC bibliotek
Overvinner vanskelighetene med repeterte sekvenser Figure 10.13Figure 10.13
27. Begrensninger ved hel-genom sekvensering Noe DNA kan ikke klones
F.eks. heterokromatin
Noen sekvenser omarrangeres eller opprettholder delesjoner nr de klones
Fremtidig stor-genom sekvensering vil bruke begge typer shotgun tilnrming
28. Sekvensering av det humane genom Det meste av prosessen skjedde ilpet av det siste ret av prosjektet
Instrumentforbedringer 3545,600 bp/dag
Automatisert fabrikkmessig produksjonslinje skaffet tilstrekkelig DNA til forsyne sekvensatorene daglig
Store sekvenseringssentra med 100-300 instrumenter 103,680,000 bp/dag
29. Integrering av koblings-fysiske- og sekvenskart Gir en kontroll av den riktige rekkeflgen av hvert kart mot de to andre
SSR og SNP DNA koblingsmarkrer ble raskt integrert inn i fysiske kart ved PCR analyser gjennom innsatte kloner i fysiske kart
SSR, SNP (koblingskart), og STS markrer (fysiske kart) har unike sekvenser p 20 bp eller mer og tar hensyn til plassering p sekvenskart
30. Forandringer i biologi, genetikk og genomiks fra den humane genomsekvens Genetikkens viktige punkter s langt
Fremskynder gen-finning og gen-funksjons analyse
Sekvensidentifisering i andre organismer gjennom homologi
Gen funksjon i en organisme hjelper til med forst funksjon i en annen med hensyn p ortologe og paraloge gener
Gener koder ofte for ett eller flere protein domener
Tillater gjetning p funksjon av nye proteiner ved sammenligning av protein sekvenser i databaser over alle kjente domener
Rask tilgang til identifisering av kjente humane polymorfismer
Fremskynder kartlegging av nye organismer ved sammenligning
F-eks. Mus og mennesker har hy likhet i geninnhold og rekkeflge
31. Hvordan transkripsjonsfaktor-proteindomener har utbredd seg i spesielle slekter Figure 10.14Figure 10.14
32. Konserverte segmenter i sammensatte blokker i humane og muse-genomer Figure 10
10.15Figure 10
10.15
33. Hovedinnsikt fra human- og modellorganismesekvenser Omkring 40,000 humane gener
Gener koder for ikke-kodende RNA eller proteiner
Repeterte sekvenser utgjr > 50% av genomet
Tydelige typer av genorganisering
Kombinasjonsstrategier gir ket genetisk informasjon og ker mangfoldet
Evolusjon ved lateral overfring av gener fra en organisme til en annen
Menn har dobbelt s hy mutasjonsgrad som kvinner
Humane raser har veldig f unike kjennetegnende gener
Alle levende organismer stammer fra en felles stamfar
34. Gjenstende sprsml omkring det Humane Genomet Vanskelig presist ansl antall gener p nvrende tidspunkt
Det fullstendige genom er ikke nyaktig sekvensert
Sm gener er vanskelige identifisere
Noen gener blir sjelden uttrykt og har ikke normalt kodon bruksmnster derfor vanskelige pvise
35. Ikke-kodende RNA gener Transport RNAer (tRNAs) tilretteleggere som oversetter triplett koder fra RNA til aminosyresekvenser av proteiner
Ribosomal RNAer (rRNAs) komponenter av ribosomet
Small nucleolar RNAer (snoRNAs) RNA bearbeiding og basemodifisering i kjernen
Small nuclear RNAer (sncRNAs) - spleisosomer
36. Protein kodende gener danner proteomet Proteome kollektiv translation av 30,000 proteinkodende gener over i proteiner
Kompleksiteten i proteomet ker fra gjr til mennesker
Flere gener
Lurere kobling, kning eller minsking av funksjoneller moduler
Flere paraloger
Alternativ RNA spleising mennesker innehar betydelig mer
Kjemisk modifikasjon av proteiner er hyere i mennesker
37. Repeterte sekvenser faller inn i fem klasser Transposon-avledete repetisjoner
Bearbeidede pseudogener
SSRs
Segmentielle duplikasjoner p 10-300 kb
Blokker av repeterte sekvenser ved sentromerer, telomererer og andre kromosomale srtrekk
38. Gen organisering av genomet Gen familier
Nrt beslektede gener gruppert eller spredd
Gen-rike omrder
Funksjonelle eller tilfeldige hendelser?
Gen rkener
Utgjr 144 Mb eller 3% av genomet
Inneholder regioner som er vanskelige identifisere?
F.eks store gener nuklere transkripter utgjr 500 kb eller mer med veldig store introns (exons < 1% of DNA)
39. Lateral overfring av gener > 200 humane gener kan ha oppsttt ved overfrsel fra organismer som bakterier
Lateral overfrsel er direkte overfrsel fra gener fra en art til kjnnscellene til en annen
40. Dobbelt s hy mutasjonsgrad i menn Sammenligning av X og Y kromosomer
Det samme kan vre tilfelle i autosomer, men vanskelig mle
Hovedmengden av humane mutasjoner skjer i menn
Menn gir opphav til flere feil, men ogs mer mangfold
41. Menneskeraser har tilsvarende gener Genom sekvenssentra har sekvensert betydelige deler av minst tre raser
Variasjonsbredden av polymorfismer innen en rase kan vre mye strre enn variasjonsbredden mellom to individer av forskjellig rase
Veldig f gener er rasespesifikke
Genetisk er mennesker en enkelt rase
42. Alle levende organismer er en enkelt rase Alle levende organismer har bemerkelses- verdige like genkomponenter
Livet oppstod en gang og vi er etterkommere av den hendelsen
Analyse av passende biologiske systemer i modellorganismer gir grunnleggende innsikt i de tilsvarende humane systemer
43. Hyeffektive instrumenterDNA sekvensator Figure 10.23Figure 10.23
44. Hyeffektive instrumenter eks, mikromatriser (arrays) Figure 10.24Figure 10.24
45. Figure 10.25Figure 10.25
46. Massespektrometer Figure 10.27Figure 10.27
47. Sosiale, etiske, og rettslige sprsml Privatisering av genetisk informasjon
Begrensninger ved genetisk testing
Patentering av DNA sekvenses
Samfunnets syn p eldre mennesker
Opplring av leger
Human genetisk ingenirkunst
Somatisk gen terapi innsetting av erstatningsgener
Kjnnscelle terapi modifikasjon p de humane kjnnsceller