培养基的配制

1. 培养基的配制

2. 内 容 一、培养基的种类 二、培养基的成分 三、培养基的表示方法 四、母液的配制 五、培养基的配制 六、培养基的分装 七、培养基的灭菌 八、培养基的筛选

3. 一、培养基的种类 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。

4. 因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。

5. 培养基的分类方式 ㈠根据其态相不同 ㈡根据培养物的培养过程 ㈢根据其作用不同(试验目的) ㈣培养基化学成分的差异及其在应用中所表现的不同特征分

6. ㈠培养基根据其态相不同 1、固体培养基 加凝固剂（多为琼脂）的培养基。 优点：使用方便，占地不大。 缺点：培养外植体只能有部分组织与培养基接触，培养物上下部因接受养分不均匀，引起组织生长的差异。 2、液体培养基 不加凝固剂的培养基。 优点：培养物吸收营养比较充分，容易获得均匀一致的细胞群体。 缺点：转换培养基较麻烦。

7. ㈡培养基根据培养物的培养过程 1.初代培养基 是指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体的培养基。 2.继代培养基 是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。

8. ㈢培养基根据其作用不同(试验目的) 1、诱导培养基 （脱分化培养基）： 外植体诱导发生愈伤组织的培养基。 eg.水稻诱导愈伤组织时加2.4-D；而烟草、胡萝卜既需生长素，又需细胞分裂素。 2、增殖培养基： 诱导出愈伤组织后，使愈伤组织能不断地生长下去的培养基。

9. 3、分化培养基： 由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的培养基。 ① 不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。 ② 加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。如烟草、矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒挂金钟等组织的分化。贴梗海棠:MS+BA3+IAA0.1+NAA0.2 ③ 需要有一种或一种以上的生长素的培养基，如枸杞、苜蓿、百合、唐菖蒲等。 ④ 只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、小麦等。

10. 4、生根培养基： 诱导再生小苗生根的培养基。 • 在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良好的根系。如烟草、红薯、草莓、枸杞等。 • 有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以诱导根。 • 有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用MS 培养基中1/2或1/4的无机盐诱导生根，常可获得良好的效果。

11. ㈣根据培养基化学成分的差异及其在应用中所表现的不同特征分：㈣根据培养基化学成分的差异及其在应用中所表现的不同特征分： • 高盐成分培养基：MS、LS、BL、BM、ER • 硝酸盐含量较高的培养基：B5、N6、LH、GS • 中等无机盐含量的培养基: H、Nitsh、Miller • 低无机盐类培养基:改良WH、WS

12. 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，一直根据沿用的习惯，多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，一直根据沿用的习惯，多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。

13. 目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下： MS培养基配方 1. MS培养基 无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培养基高。应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。 2. B5培养基 含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。适宜双子叶植物，特别是木本植物。 3. White培养基 成分比较简单，无机盐和糖的用量低，适于生根培养。

14. 4. N6培养基 成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养和其它组织培养。 5.KM-8P培养基 有机成分较复杂，包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质体融合培养。 6.ER培养基 与MS培养基相似，其中磷酸盐含量比MS高1倍，但微量元素含量较低，适于细胞培养。 N6培养基组成及配方

15. 7.NT培养基 适于烟草叶肉原生质体培养。 8.DKW培养基 中等养分浓度的培养基，适于多种木本植物组培。 9.WPM培养基 低浓度的培养基，是适合多种木本植物培养。 10.BL培养基（1965） 其成分基本同MS，惟去掉甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素，增加天冬酰胺。

16. 11.H培养基（1967） 大量元素无机盐约为MS的一半，磷酸二氢钾及氯化钙稍低；微量元素的含量较MS高但种类少，维生素种类较多。 12.SH培养基（1972） 硝酸钾含量较高，铵与磷酸是以NH4H2PO4提供的。 13.WS培养基（1966） 无机盐含量低，微量元素种类少。适用于某些树种的生根培养。 14.HE培养基（1953） 钾盐和硝酸盐是通过不同化合物来提供。无机盐含量稍低。

17. 15.LS培养基（1965） 与MS培养基的许多方面完全相同，只是维生素略有区别。 16.Miller培养基（1963） 用于多种作物的花药培养。 17.KC培养基（1946） 大量用于兰科各属无菌种子发芽及组织培养，琼脂在使用时可酌减。

18. 二、培养基的成分 对于整株植物生长所需要的这些营养元素，对于组培来说也是必须的。培养基是外植体生长的土壤，它包含了培养物生长发育所需的各种必须营养元素，有时根据需要，还加入一些有益元素。培养基的营养元素以有机物和无机物2类存在，绝大多数营养元素以无机物形式存在。培养基的成分主要可以分水、 无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。

19. ㈠水 ㈡无机营养元素 ㈢有机营养成分 ㈣植物生长调节物质 ㈤培养材料的支持物 ㈥抗生素 ㈦抗氧化物 ㈧活性炭 ㈨染色剂 ㈩培养基的PH值 培养基的成分

20. 作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 注意： 在研究工作中配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质,引起不良效果。 工厂化大量生产时，可考虑用来源方便的水源，原则是无毒害，水质软，配制培养基不会产生沉淀（包括高压灭菌后不沉淀）。 在农村可试用河水或井水，城市中试用自来水，用这样的水配制成培养基，试用几种植物在其上生长3-4代（约4-6个月），如无显著影响，便可扩大应用。 ㈠水（water)

21. ㈡无机营养元素(inorganic element) 1、大量元素： 指浓度大于0.5mmol／L的元素。 [C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca]。 2、微量元素： 指浓度小于0.5mmol／L的元素。 铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、 钼（Mo）、硼（B）、碘（I）、钴（Co）、 氯（Cl）、钠（Na）等

22. 知 识 窗 • N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分， 是生命不可缺少的物质；无机氮在培养基一般以硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）两种形式供应，单独使用NO3- PH值向碱性方向偏移；单独使用NH4+PH值向酸性方向偏移，因此大多数培养基即含NO3-又含NH4+。 • P是磷脂的主要成分。而磷脂又是细胞膜、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在组培过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累；培养基中常用KH2PO4或NaH2PO4。 • K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系，它具有活化酶的作用。Ｋ增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mg/l为好；制备培养基时，常以KNO3和KCl等盐提供。 • Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用；CaCl2·2H2O形式提供。 • Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；MgSO4·7H2O形式提供。 • S是含S蛋白质的组成成分。

23. 知 识 窗 这两类元素在培养基中的含量虽然相差悬殊，但都是离体组织生长和发育必不可少的基本的营养成分。 • 氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛，若磷肥又不足，则不开花或花期延迟。 • 磷 为开花结实不可缺少的元素。缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。 • 钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。 • 镁 镁是构成叶绿素的成分。缺镁，叶片边缘及中央部分失绿而变白，叶脉出现色斑。 • 硫 缺硫，变为淡绿，进而变白。 • 铁 缺铁，细胞分裂停止，绿叶变黄，进而变白。 • 锰 缺锰，叶片上出现缺绿斑点或条纹。 • 锌 缺锌，叶子变黄，或出现白斑，叶子小。 • 钙 钙促进幼根生长。缺钙，嫩叶失绿，叶缘向上卷曲，出现白色条纹。 • 硼 缺硼，叶失绿，叶缘向上卷曲，顶芽死亡。 • 钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。

24. 当某些营养元素供应不足时，愈伤组织会表现出如下缺素症状：当某些营养元素供应不足时，愈伤组织会表现出如下缺素症状： • 氮：某些组织（五叶地锦）表现出一种很引人注目的花色素苷的颜色，不能形成导管； • 钾或磷：细胞过度生长，形成层组织减退； • 硫：明显褪绿； • 铁：细胞分裂停止，影响叶绿体的结构组成及叶绿素形成，出现失绿症状； • 硼：细胞分裂停滞，细胞伸长； • 锰或钼：影响细胞伸长。

25. 3、铁盐 作用：是一些氧化酶的组成成分。同时又是叶绿素形成的必要条件。培养基中铁对胚的形成，芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 注意： • 在微量元素中，铁的用量较大，铁是由于培养基PH值较高（PH值5.2以上）的情况下，所使用的三氯化铁等铁盐容易产生氢氧化铁沉淀，难以为培养的植物材料吸收而导致缺铁症（愈伤组织由于能分泌与铁离子相结合的稳定螯合物，可以在一定程度上利用铁盐）。为了保证铁素的稳定供应，现在培养基中几乎都采用Fe-EDTA形态的铁盐。 • 早期采用过硫酸铁和氯化铁，但它们都不是理想的铁供应源。在根培养时，接种一周，采用氯化铁的培养基PH值就由4.9-5.0偏移到5.8-6.0，跟开始表现出缺铁症。 • Na-Fe-EDTA可以从试剂商店买到，也可以用螯合剂Na- EDTA和FeSO4·7H2O来配制，制得的溶液即为螯合铁，作为铁的供应源。

26. ㈢有机营养成分(organic compound) 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。 常加入的有机成分主要有以下几类： 1、碳源 2、维生素 3、肌醇（环己六醇） 4、氨基酸 5、有机附加物

27. 1、碳源 • 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，其中以糖类物质最为重要。一般来说，蔗糖是最好的碳源，它具有热易变的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，仅剩下部分蔗糖，这更有利于植物的吸收和利用。此外，也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。 • 不同糖类对植物生长的影响不同， 如以蔗糖为碳源时，立体的双子叶植物的根生长的更好。而以葡萄糖作为碳源时，单子叶植物的根生长得最好。

28. 碳源作用：在组织培养中用作离体组织生长的碳源，维持培养基一定的渗透压。碳源作用：在组织培养中用作离体组织生长的碳源，维持培养基一定的渗透压。 蔗糖使用浓度：一般在2～3%，常用3%，即配制1升培养基称取30g蔗糖，但在胚培养时采用4～8%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。

29. 生长培养基是植物再生的必要条件 蔗糖 （0%） 外植体完全被绿色的芽所包裹，根生长在其下表面 在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生 tissue culture in the African Violet 非洲紫罗兰 的组培 蔗糖含量（ 5%） 蔗糖含量（1%） 芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生 在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生

30. 2、维生素(vitamin) 作用：在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动对离体组织的生长具有明显的促进作用，主要为B族维生素 。 种类： VBl(盐酸硫胺素)、 VB3（泛酸）、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(VB5烟酸) Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素) VBC(VM叶酸)、 VB12（钴胺素) VB2（核黄素）等。 VB1一般认为是一种必需的成分。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。 使用浓度：一般用量为0.1-1.0mg／L。 VC用量一般为1～100mg/L，培养基中高浓度VC的使用并不一定是植物生长需要，而是作为抗氧化剂，以防止组织褐变。 。

31. 3、肌醇（环己六醇） 在糖类的相互转化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

32. 4、氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及水解酪蛋白、水解乳蛋白（牛乳用酶法等加工的水解产物，含有约二十种氨基酸的混合物）等。 使用浓度：为10～1000mg/L。 由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。

33. 当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作用是促进细胞生长。如：当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作用是促进细胞生长。如： 酪蛋白水解物和胰蛋白水解产生的胨能增进国兰类组织的生长，300mg/L谷氨酰胺也能起到同样的作用，精氨酸对卡特兰、万代兰未成熟的种子有刺激其生长的作用，天门冬酰胺有促进国兰类籽苗生长的作用

34. 10%—20% 150-200ml／L 150—200g／L 0.01%-0.05% 0.01%-0. 5% 5、有机附加物 （天然复合物） 成分不固定，主要有效成分大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 作用：它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。 浓度

35. 还有应用苹果汁、番茄汁、黄瓜、未熟玉米胚乳樱桃汁、落地生根属植物的浸提物，甚至人参、西洋参和天然蜂王浆等，还有应用苹果汁、番茄汁、黄瓜、未熟玉米胚乳樱桃汁、落地生根属植物的浸提物，甚至人参、西洋参和天然蜂王浆等， • 这些成分不定的复杂天然物质，由于受到产地、季节、气候、株龄及栽培条件等多种不同因素的影响，其含有的有利于生长或分化的成分，在质量或数量上都会有不同，以至于试验结果不易重复， • 因此，应尽量避免使用这些天然复合物，仍以采用成分确定的化合物来代替天然产物更为可靠。 • 如: 在组织培养蝴蝶兰时，常加入香蕉泥或椰乳，可明显促进原球茎发育成完整植株并加速小苗的生长。

36. ㈣植物生长调节物质(hormone) 植物生长调节物质是一些对植物生长发育及生理活动有特殊作用的生理活性物质。 这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用，有些可以刺激植物生长，而有些抑制植物生长。 在组织培养中，植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、器官分化的植株再生具有重要的作用。

37. 植物生长调节物质类型： ①植物激素：体内产生的（内源的），可移动的，含量甚微的生理活性物质。 如：IAA、KT、GA3、ABA、乙烯 ②植物生长调节剂：人工合成的，与植物激素有相同的化学组成和结构，相似或相近的生理功能的生理活性物质。 如：与IAA具有相似功能的IBA、NAA等 IBA IAA

38. 国际公认的植物激素主要包括5大类： 生长素类(auxin) 促进生长 细胞分裂素类 ( cytokinin ) 赤霉素（gibberellic acid） 抑制生长 脱落酸（ABA） 乙烯（Eth）

39. 1、生长素类 • 组培中的作用： • 诱导愈伤组织的产生， • 促进细胞脱分化 • 组织培养促进细胞伸长 • 促进生根 农业生产中的作用： • 插枝生根 • 防止器官脱落 • 诱导菠萝开花 • 促进果实形成 • 用量：mg/L级，mg/L=ppm • 用法：溶于95％乙醇或0.1mol/L NaOH

40. 生长素类在组培中常见剂型

41. ABT生根粉是中国林科院林业研究所王涛研究员研制的一种广谱高效的生根促进剂。是一种复合型的植物生长调节剂，共有10个型号。ABT生根粉是中国林科院林业研究所王涛研究员研制的一种广谱高效的生根促进剂。是一种复合型的植物生长调节剂，共有10个型号。 主要作用是：能提供插条生根所需的生长促进物质；能促进插条内源激素的合成；能促进一个根源基分化形成多个根尖，以诱导插条不定根的形态建成。

42. 此外，在组培中，还有一些具有类似生长素性质的其它化合物已被应用，如吲哚丙酸（IPA）、萘氧乙酸（NOA）、2,3,5-三氯苯氧乙酸（2,3,5-T）、对氯苯氧乙酸（p-CPA）等,其中2,3,5-T的作用类似2,4,- D。

43. 2、细胞分裂素类 生理作用和应用： 1）促进细胞分裂和扩大 在组织培养中，当培养基缺少细胞分裂素时，细胞很少分裂、生长，加入细胞分裂素后，细胞就进行分裂，组织增大，产生愈伤组织。细胞分裂素可以使细胞横向扩大而不是伸长。 在生产中可以对绿肥、叶用蔬菜等叶用作物施用一些细胞分裂素，能够增产。

44. 2）延迟衰老和保鲜 作用原理：阻止核酸酶和蛋白酶等水解酶的产生；阻止营养物质向外流动并使其向细胞分裂素所在的部位运输，促进物质的积累。 在生产上可以用于防止贮藏蔬菜的变质，延长贮藏时间。

45. 3）诱导芽的分化 在愈伤组织的分化培养中，产生根或芽，取决于生长素与细胞分裂素浓度的比值。 例如，在烟草愈伤组织培养时，当激动素：生长素为0.02：2mg/L时，能诱导根的分化；两者比值为0.2： 2mg/L时，愈伤组织只生长不分化；当激动素的比例提 高到0.5：2mg/L时，能诱导芽的分化。

46. 4）其他 促进侧芽发育，防止果树生理落果， 可打破种子的休眠，促使其发芽。

47. *组培中细胞分裂素作用： ①促进细胞分裂与扩大。 ②诱导芽分化，促进侧芽萌发。 ③抑制根的分化。 用量：mg/L级 用法：溶于0.5mol/L 稀HCl或稀NaOH，通常多用1M的HCl中或1 M的NaOH中助溶。

48. 细胞分裂素类在组培中常见剂型 ★

49. ★注意：生长素类与细胞分裂素类在组培中的相互作用★注意：生长素类与细胞分裂素类在组培中的相互作用 1、相互依存： CK类 IAA类 愈伤组织 IAA类 芽分化增殖 CK类 2、相互对立： IAA类/ CK类 比例高 促进愈伤组织的形成 IAA类/ CK类 比例低 促进芽的分化和增殖 去掉CK类，只有IAA类 促进生根

50. BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No BAP More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant NAA reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation