Promotor : Dr hab. n. med. Jerzy Mackiewicz

1. Uniwersytet Medyczny w Lublinie Katedra i Klinika Okulistyki Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski Monika Jasielska Rola receptoraczynnikamartwicyguza α Rp75 (TNFRp75)wpowstawaniuneowaskularyzacjinaczyniówkowej Promotor: Dr hab. n. med. JerzyMackiewicz Lublin 2010

2. Neowaskularyzacja naczyniówkowa (choroidal neovascularization – CNV) • rozrost małych naczyń pochodzących z naczyń włosowatych naczyniówki, które poprzez błonę Brucha przedostają się do przestrzeni pod nabłonkiem barwnikowym siatkówki, jak i w obręb komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i fotoreceptorów; • patologiczne naczynia są niepełnowartościowe, mniej wytrzymałe, bardziej kruche i mają kręty przebieg; • nieszczelność nowo powstałych naczyń skutkuje przeciekiem płynu lub krwi, które, kumulując się w przestrzeni podsiatkówkowej, powodują surowicze lub krwotoczne odwarstwienie nabłonka barwnikowego siatkówki; • prowadzi do powstania tarczowatej, włóknistonaczyniowej blizny

3. Neowaskularyzacja naczyniówkowa

4. Neowaskularyzacja naczyniówkowa • Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (age-relatedmaculardegeneration – AMD) to degeneracyjna choroba oczu, która jest najczęstszą przyczyną poważnego upośledzenia widzenia u osób po 50. roku życia w krajach rozwiniętych. • Istotą tego schorzenia jest pojawienie się zmian w centralnej części siatkówki, w plamce żółtej, która odpowiada za widzenie centralne. • Choroba ta prowadzi do ograniczenia w znacznym stopniu zdolności wykonywania codziennych podstawowych czynności (np. czytania, prowadzenia samochodu). AMD w znacznym stopniu obniża jakość życia, skazuje osoby dotychczas samodzielne na opiekę osób trzecich oraz często w znacznym stopniu obciąża ekonomicznie pacjenta i jego rodzinę. • W ostatnich latach obserwujemy stale rosnącą, liczbę chorych na AMD, co jest związane z procesem starzenia się społeczeństw i powoduje występowanie chorób typowych dla wieku podeszłego (w tym AMD) na skalę epidemiczną. • Przypadki zachorowań na AMD szacuje się na 2-10% u osób powyżej 50. roku życia i ponad 13% – po 85. roku życia. Szacuje się, że liczba chorych w ciągu najbliższych 25 lat wzrośnie trzykrotnie. Można zatem uznać, że w przypadku AMD mamy do czynienia z chorobą społeczną.

5. Koncepcje powstawania CNV • zaburzenie równowagi pomiędzy czynnikami proangiogennymi (czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor; VEGF), czynnik wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor; FGF), płytkopochodny czynnik wzrostu (plateled-derived growth factor; PDGF), czynnik martwicy guza α (tumor necrosis factor α; TNFα) i antyangiogennymi (czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego siatkówki (pigment epithelium derived factor – PEDF), angiostatyna, endostatyna) • rola hipoksji, niedokrwienia, procesu zapalnego; • zaburzenie funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki; • dysfunkcja naczyń włosowatych naczyniówki Miller D.W.et al. 2003

6. Laserowy model CNV • Indukowanie energią lasera pęknięć w błonie Brucha w celu inicjacji neowaskularyzacji naczyniówkowej, której towarzyszy niespecyficzna, lokalna reakcja zapalna. Nabłonek barwnikowy siatkówki Błona Brucha Naczynie włosowate naczyniówki CNV

7. Czynnik martwicy guza α (TNFα) czynnik martwicy nowotworów, kachektyna, inicjujący czynnik różnicujący (differention-inducingfactor - DIF) • plejotropowa cytokina prozapalna, regulująca różnicowanie i wzrost komórek; • wyizolowany po raz pierwszy w 1975 roku jako czynnik odpowiedzialny za martwicę mięsaka myszy; • trimeryczne białko kodowane przez gen X02910/X02159 w segmencie 6p23-6q12 na chromosomie 6; • u osób dorosłych ekspresja tego genu, charakterystyczna przede wszystkim dla makrofagów i monocytów, a w mniejszym stopniu dla komórek NK, limfocytów, neutrofilii, komórek tucznych, fibroblastów, keratynocytów, adipocytów; • występuje w formie rozpuszczalnej (17 kD) i transbłonowej (27 kD)

8. Czynnik martwicy guza α (TNFα) długotrwałe wydzielanie TNFα, indukującego lipolizę oraz pobudzającego wydzielanie hormonów katabolicznych, prowadzi do kacheksji wpływ na komórki układu odpornościowego oraz uczestniczące w regulacji reakcji immunologicznej powoduje martwicę pewnych typów nowotworów, ale również promuje wzrost innych typów komórek nowotworowych białko ostrej fazy, które inicjuje aktywację kaskady cytokin i zwiększa przepuszczalność naczyń, rekrutuje makrofagi i neutrofile do miejsca zapalenia częściowo odpowiedzialny za insulinooporność TNFα niskie stężenie TNFα pomocne w utrzymaniu zrównoważonego dobowego rytmu ciała odpowiedzialny za powstawanie zmian miażdżycowych i niewydolności krążenia, zapalenie trzustki oraz alkoholowe uszkodzenie wątroby udział w schorzeniach autoimmunizacyjnych, w odrzucaniu przeszczepów, w reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi oraz w przebiegu AIDS

9. TNFα w powstawaniu CNV TNFα Ekspresja VEGF przez komórki nabłonka barwnikowego siatkówki Ekspresja białek adhezyjnych (tj.: ICAM-1, VCAM, CD18) przez komórki śródbłonka i leukocyty Aktywacja białek jądrowego czynnika kappa B (NFκB)

10. Receptory czynnika martwicy guza α

11. Cel pracy • ocena angiogennej aktywności czynnika martwicy guza α (TNFα) • określenie roli receptorów TNFα: TNFRp55 i TNFRp75 w powstawaniu neowaskularyzacjinaczyniówkowej

12. Materiał i metody • myszy linii C57/BL6 (szczep dziki; ang. wild type, WT) - grupa referencyjna (n=10, 20 oczu) • myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp55 (TNFRp55-/-) (n=10, 20 oczu) • myszy transgeniczne - knockout względem receptora TNFRp75 (TNFRp75-/-) (n=10, 20 oczu)

13. Materiał i metody • Fotokoagulacja laserowa: aplikacja wokół tarczy nerwu wzrokowego każdego oka pięciu ognisk laserowych o mocy 120 mW, średnicy 50 µm, czasie 100 ms

14. Materiał i metody • Angiografia fluoresceinowa 14 dni po fotokoagulacji laserowej

15. Materiał i metody • Ocena histologiczna: • Preparaty płaskie • Barwienie histochemiczne z izolektyną – ocena unaczynienia • Barwienie immunohistochemiczne z izolektyną i markerem makrofagów F4/80 – wizualizacja naczyń i komórek zapalnych • Preparaty parafinowe • Barwienie hematoksyliną i eozyną – ocena struktury siatkówki i naczyniówki • Barwienie immunohistochemiczne z czynnikiem von Willebrandta i z przeciwciałami anty-F4/80 - wizualizacja naczyń i komórek zapalnych • Barwienie immunohistochemiczne przeciwciałem anty‑Bmx – ocena proliferacji komórek • Barwienie TUNEL – detekcja apoptozy komórek

16. Materiał i metody • Analiza Western blot • Ocena ekspresji białek czynnika martwicy guza α • Ocena ekspresji białek kaspazy 3 i kaspazy 8

17. Wyniki • Ekspresja TNFα w nabłonku barwnikowym siatkówki i w naczyniówce myszy linii C57/BL6, TNFRp55-/- i TNFRp75-/-, poddanych dzień wcześniej i dwa tygodnie wcześniej fotokoagulacji laserowej (+) i myszy nielaserowanych (-). 1 dzień po fotokoagulacji 2 tygodnie po fotokoagulacji

18. Wyniki • Angiografia fluoresceinowa

19. Wyniki • A.Ogniskaneowaskularyzacji naczyniówkowej obserwowane 14 dni po fotokoagulacji laserowej myszy TNFRp55-/- , TNFRp75-/- i myszy C57/BL6 w preparatach płaskich barwionych izolektyną IB4. Powiększenie 20x. • B. Kwantyfikacja wielkości ognisk neowaskularyzacji naczyniówkowej (Qm2) w preparatach płaskich barwionych izolektyną.

20. Wyniki • A. Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej w preparatach płaskich myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 – nałożone obrazy podwójnego barwienia izolektyną IB4 oraz przeciwciałami anty-F4/80. Powiększenie 20x. • B. Powierzchnia ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej zajmowana przez F4/80-dodatnie komórki (wyrażona w % powierzchni ogniska). • C. Powierzchnia zajmowana przez makrofagi poza granicami ognisk lasera.

21. Wyniki • Ogniska neowaskularyzacji naczyniówkowej w preparatach myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 14 dni po zastosowaniu energii lasera argonowego. Powiększenie 20x. Barwienia H+E, czynnikiem von Willebrandta, przeciwciałem anty-F4/80.

22. Wyniki • Ekspresja białek kaspazy 3 i kaspazy 8 w nabłonku barwnikowym siatkówki i naczyniówce myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 tydzień po fotokoagulacji laserowej w analizie Western blot. • Wyniki analizy densytometrycznej ekspresji kaspazy 3 i kaspazy 8 trzech prążków trzech różnych badań (±SEM).

23. Wyniki • Wyniki barwienia TUNEL oraz DAPI preparatów parafinowych siatkówki i naczyniówki myszy TNFRp55-/-, TNFRp75-/- i C57/BL6 dwa tygodnie po fotokoagulacji laserowej. Powiększenie 20x.

24. Wnioski • Receptory czynnika martwicy guza α: TNFRp55 i TNFRp75 biorą udział w patomechanizmie powstawania neowaskularyzacji naczyniówkowej po laserowej fotokoagulacji u myszy. • W przebiegu neowaskularyzacji naczyniówkowej interakcje czynnika martwicy guza α z receptorami TNFRp55 i TNFRp75 aktywują dwie odmienne drogi, z których pierwsza prowadzi do apoptozy, a druga do proliferacji i migracji komórek śródbłonka naczyń. • Wyłączenie funkcji receptora TNFRp75 może skutkować zmniejszeniem procesu zapalnego oraz ograniczeniem powierzchni neowaskularyzacji naczyniówkowej, a tym samym mniejszym uszkodzeniem tkanek u chorych z objawową neowaskularyzacją naczyniówkową. • Przedstawione dowody wskazują na potencjalne możliwości leczenia neowaskularyzacji naczyniówkowej, wykorzystujące wiedzę na temat roli receptorów TNFRp55 i TNFRp75 w powstawaniu neowaskularyzacji naczyniówkowej.

25. Ze względu na wzrastającą liczbę osób w wieku podeszłym i rozpoznawanie u nich nowych, dotychczas nieznanych chorób narządu wzroku, konieczne jest nasilenie opieki okulistycznej w środowisku życia tych osób. Należy dołożyć wszelkich starań, aby poprawić jakość życia pacjentów dotkniętych AMD oraz zmniejszyć ekonomiczne i społeczne koszty inwalidztwa wzrokowego znacznego odsetka społeczeństwa.

26. Dziękuję

27. Uniwersytet Medyczny w Lublinie Katedra i Klinika Okulistyki Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tomasz Żarnowski Monika Jasielska Rola receptoraczynnikamartwicyguza α Rp75 (TNFRp75)wpowstawaniuneowaskularyzacjinaczyniówkowej Promotor: Dr hab. n. med. JerzyMackiewicz Lublin 2010