RT-PCR 技术检测基因表达情况

1. RT-PCR技术检测基因表达情况

2. PCR扩增 逆转录 实验过程 RNA制备 电泳检测RNA完整性 RNA纯化

3. RNA制备 1) 所用的玻璃器皿和金属器械均高压灭菌，经180 0C干烤5小时，Eppendorf管（Ep管）及Tip头经DEPC水浸泡，37 0C过夜，高压烘干备用； 2)取适当肿瘤组织，用手术剪尽量剪碎, 加1ml TriZol, 放入玻璃匀浆器中匀浆， 转移至Ep管， 冰上放置5分钟； 3)加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，冰上放置2-3分钟； 4)4 0C,12000rpm离心15 min， 取上清液至另一新的Eppendorf管中； 5)加入500μl（等体积）异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min； 6)4 0C,12000rpm离心10min，弃上清，防止沉淀丢失； 7)加1ml 75%乙醇洗涤，旋涡振荡器振荡使沉淀分散； 8)4 0C,7500rpm离心5min，弃上清； 9)晾干沉淀，加入20μl无RNase水，55 0C -60 0C水浴10分钟助溶； 10)分装后-70 0C保存。

4. RNA纯化 1)按以下次序在已灭菌的0.5ml EP管内分别加入各反应成分 无RNase 水 5.5μl 10×DNase I buffer 2.0μl RNase 抑制剂 0.5μl DNase I (RNase free) 2.0μl RNA 10μl 混匀，37 0C,水浴30min 2）加入80ul无RNase 水补足体积至100μl; 3) 加入等体积酸性酚：三氯甲烷（5：1）剧烈振荡15秒，冰上静置2-3分钟； 4）4 0C,12000rpm离心15 min，后取上清液至另一新的Eppendorf管中； 5）加入0.1倍体积 3M乙酸钠，3倍体积100%乙醇，颠倒混匀，-70 0C沉淀1小时； 6）4 0C,12000rpm离心15 min，弃上清； 7）加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次 8）4 0C,12000rpm离心5 min，弃上清； 9）晾干沉淀，加入10μl无RNase水，55 0C -60 0C水浴10分钟助溶； 10）DU70紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度：其纯度应为 OD260/OD280=1.8-2.0 RNA浓度(ug/ml)= OD260×40 μg/ml×稀释倍数

5. 电泳检测RNA完整性 1)电泳槽依次经3%双氧水和0.05%DEPC水浸泡冲洗后列为RNA专用电泳槽； 2)制备1%琼脂糖凝胶（无RNase水配制）； 3)取2μl纯化后的RNA，1ul 6×Loading buffer，3μl无RNase 水混匀上样电泳； 4)紫外观察仪观察，凝胶成像处理系统扫描成像。

6. 1 2 3 4 5 DNA 28S 18S 5S 图3 纯化前后的RNA电泳结果 （1泳道， 纯化后的RNA；2、3、4、5泳道，纯化前的RNA）

7. 逆转录 1)取5μl纯化后的总RNA加入2μl Oligo(dT )18 ，补无RNase水至12.5μl，70 0C变性10分钟，迅速置于冰上5分钟； 2)按以下次序EP管内分别加入各反应成分 5×AMV buffer 4.0μl 10mMdNTP 2.0μl RNase抑制剂 0.5μl 3)37 0C温育2分钟后加入AMV 1μl，37 0C温育 1小时 4)93 0C 10分钟以灭活AMV ，立即冰浴，-20 0C保存

8. PCR扩增 基本步骤 RT-PCR检测基因转录情况 引物的定制 及稀释 检测PCR 平台期 观察

9. MMP-9引物、β-actin引物由申能博彩公司合成，根据公式：n摩尔数＝OD值×100／碱基数，将引物稀释成20pmol/μl，分装后-70℃冰箱内保存。引物在原序列中的碱基对位置及由引物特异性扩增的PCR产物长度见表。 MMP-9引物、β-actin引物由申能博彩公司合成，根据公式：n摩尔数＝OD值×100／碱基数，将引物稀释成20pmol/μl，分装后-70℃冰箱内保存。引物在原序列中的碱基对位置及由引物特异性扩增的PCR产物长度见表。 表. 引物序列及扩增片段长度

10. 1)以同一cDNA为模板，摸索最佳PCR反应条件； 2)固定PCR反应体系，分别进行24，27，30，33，36个循环的扩增（检测基因的平台期） 3)紫外观察仪观察，凝胶成像处理系统扫描成像； 4) Gel Pro 3.2 分析软件分析各条带亮度。

11. 图4-2 检测RT-PCR平台期的循环梯度曲线 （系列1，内参；系列2，目的基因） 分析结果：33个循环后PCR扩增进入平台期，本实验选择30个循环。

12. 2) PCR反应体系 10×PCR Buffer 2μl dNTP (2.5mM) 2μl 上游引物 (20pmol/μl) 1μl 下游引物 (20pmol/μl) 1μl cDNA 5μl TaqE (5U/μl) 0.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 用DEPC水补足反应体系到25μl，在基因扩增仪：PTC-100（美国MJ research Watertown，Inc公司）上行扩增反应。

13. 1) MMP-9 PCR：96℃预变性3 min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，-20℃保存。 2)β-actin PCR：95℃预变性3min，95℃变性50sec，56℃退火50sec，72℃延伸30sec，根据预实验平台期检测结果确定循环数为28个，最后72℃延伸5min，-20℃保存。

14. 1)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；1)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳； 2)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TBE缓冲液，使液面略高于凝胶。 3)从反应混合液中取出DNA扩增产物2 ul并加1ul 6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。 4)电泳100V约1小时； 5)在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (EB终浓度0.5-1ug/ml),混匀； 6)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟； 7)取出凝胶，用水稍漂洗； 8)紫外灯下确定DNA区带。

15. 以β-actin为内参照进行质控与标化，在PCR反应到达平台前取扩增产物电泳检测；以β-actin为内参照进行质控与标化，在PCR反应到达平台前取扩增产物电泳检测；

16. PCR扩增产物的量 • 最初模板DNA的量 mRNA的提取效率及逆转录反应的回收率 PCR扩增效率的差异 PCR的平台效应

17. 利用内部标准物质进行RT-PCR的 mRNA定量 在任何组织或细胞中都几乎以同样的速度（效率）进行表达的内在遗传物质---管家基因的转录产物 通过对比目的与内部标准物量的比较，得到只是比内部标准物多或少的相对结果，并不受其它因素影响。

18. 组织、细胞 mRNA 逆转录 内部标准物 cDNA PCR 电泳、EB染色 比较、定量

19. 利用Gel-pro32图象分析软件对凝胶进行密度扫描，以看家基因为内对照，对各条带进行比较分析 , 得出OD值

21. 计算方法为: mRNA表达相对值 =目的片断吸光度值/β-actin吸光密度值

22. 剥离肿瘤称重 用电子天平称瘤重，计算抑瘤率。 抑瘤率（％）＝（1－实验组平均瘤重/生理盐水对照组平均瘤重）×100％。 使用两药相互作用系数(coefficient of drug interaction,CDI)评价两药相互作用性质, CDI按下式计算:CDI=AB/(A×B),AB是联合用药组与对照组平均瘤重的比值,A或B是各单药组与对照组平均瘤重的比值。CDI<1,则两药作用性质为协同,CDI=1表示两药作用性质为相加,如CDI>1则两药作用性质为拮抗。

23. 免疫组化评分 每例切片随机选择5个高倍视野（×400），统计阳性细胞数量和着色程度，取其平均值， 评分标准：采用免疫组化评分（HIS值）法 进行统计：A为阳性细胞数，分级0%=0、1～10%=1、11～50%=2、51～80%=3、81～100%=4；B为阳性细胞显色强度分级0（无显色，阴性）、1（浅黄色，弱阳性）、2（棕黄色，阳性）、3（棕褐色，强阳性），以A与B之乘积作为IHS值，用于免疫组化评分。

24. 统计学方法 数据结果用均数±标准差（x±s）表示 采用SPSS15.0软件进行统计学分析 各组间的均数差异性比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA） 按α=0.05水平，p<0.05表示差异有显著性，p<0.01表示差异极显著性，p>0.05表示差异无显著性。

25. 结 果 1 实验各组对小鼠H22肝移植瘤抑瘤率的影响： Table 1 The inhibition rate of the tumor in tumor-bearing mice.(x±s,%) Group N Tumor weight(g) Inhibition rate（%） Tha group 10 3.67±0.44 19.52 Tha+Epi group 10 1.95±0.24 ** 57.24 Epi group.. 10 2.45±0.31 46.27 NS group.. 10.. 4.56±0.46 0 Note:compared to NS group**p<0.01

26. 2 实验各组对小鼠H22肝移植瘤MMP-9 mRNA表达的影响： Table 2 The expression.of MMP-9 mRNA in tumor-bearing mice.(x±s) Group N mRNA相对值 Tha group 10 0.3307±0.0463** Tha+Epi group 10 0.3054±0.0539** Epi group 10 0.6113±0.0629 NS group... 10 0.6732±0.1244 Note:compared to NS groupp<0.01

27. 3 实验各组对小鼠H22肝移植瘤MMP-9 蛋白表达的影响： Table 3 Scores of Immunohistochemistry of MMP-9 protein in tumor-bearing mice.(x±s) Group N MMP-9 蛋白表达 Tha group 10 2.4±0.9661** Tha+Epi group 10 2.3±0.675** Epi group 10 4.5±1.1785 NS group. 10 5.2±0.7888 Note:compared to NS group ** p<0.01

28. 研究论文:沙利度胺联合表阿霉素治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究及其机制的探讨研究论文:沙利度胺联合表阿霉素治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究及其机制的探讨 中文摘要………………………………………… 英文摘要………………………………………… 前言……………………………………………… 材料与方法……………………………………… 结果……………………………………………… 附图……………………………………………… 附表……………………………………………… 讨论……………………………………………… 结论……………………………………………… 参考文献…………………………………………

29. 讨论 背景介绍: 简要阐明本研究的背景知识, 目的,及研究意义等 实验方法的讨论(选择,优缺点比较等等) 实验结果的讨论(与其它相关研究工作进行比较) 总结性讨论 前瞻性讨论

30. 结论： 1 沙利度胺具有抑制小鼠H22肝癌移植瘤增殖的作用。 2 沙利度胺是否可协同表阿霉素对小鼠H22肝癌移植瘤增殖抑制作用。 3 沙利度胺是否可能通过下调MMP-9的表达而发挥抑制小鼠H22肝癌移植瘤增殖作用。 4 本实验证实了沙利度胺具有抗肝癌作用，并通过沙利度胺联合抗肿瘤药物表阿霉素的实验研究丰富了肝癌的治疗，为肝癌的综合治疗提供了新的选择。