Viveca Giongo Laboratório de Virologia Molecular, Departamento de Biologia Celular e Molecular/UFF

1. Como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), PCR em tempo real e o Sequenciamento de genes são ferramentas importantes na investigação científica e no diagnóstico laboratorial ? Viveca Giongo Laboratório de Virologia Molecular, Departamento de Biologia Celular e Molecular/UFF

2. Comparação dos valores de sensibilidade entre os ensaios imunológicos

3. Parâmetros para validação de um teste sorológico • Sensibilidade - refere-se à porcentagem de resultados positivos pelo teste na população doente. Verdadeiros Positivos • Sensibilidade: VP/VP+FN • Especificidade - porcentagem de resultados negativos pelo teste em indivíduos não doentes. Proporção dos verdadeiros negativos • Especificidade: VN/ VN+FP

4. A Sorologia sempre funciona ? • Alguns cuidados: IgM representa infecção recente. Certo? • Ela pode permanecer na fase de convalescença • Não indica portanto infecção recente • Infecções fulminantes por vírus, infecções com risco de evolução maligna necessitam de um diagnostico precoce

5. Biologia Molecular

6. Reação em Cadeia da Polimerase

7. Histórico... Nobel Prize, 1968 Principio da replicação do DNA Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid J. D. WATSON & F. H. C. CRICK Medical Research Council Unit for the Study of the Molecular Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. April 2 Nature 171, 737-738 (25 April 1953) | doi:10.1038/171737a

9. Thermus acquaticus JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol. 98, No. I Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE Department of Microbiology, Indiana University, Bloomington, Indiana 47401 The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient media relatively dilute with respect to the organic components. Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of thermal springs in Yellowstone National Park and from a thermal spring in California. The organism has also been isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap water, in geographical locations quite distant from thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative nonsporulating nonmotile rods which frequently form long filaments at supraoptimal temperatures or in the stationary phase. The optimum temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C. The generation time at the optimum is about 50 min.

10. Quem inventou a PCR Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54 Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35

11. Síntese de oligonucleotideos (primers) Purificação de DNA polimerase Quais foram as limitações?

12. "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry: for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"

13. PCR • Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase) • Reação enzimática de polimerização de DNA in vitro • É uma reação cíclica na qual os produtos de um ciclo são substratos para o ciclo seguinte • Amplificação de sequências específicas de DNA, permitindo sua visualização e/ou análise posterior • É um processo termodinâmico e enzimático

14. Reação para amplificação de segmento específico de DNA • Exon especifico de um gene humano

15. Cópia molecular Capaz de copiar e multiplicar parte de uma “sentença” TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCTAAGCATTTCGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGACTACGTAGCTAGACTAGATGCATAGCTAGCAGTACTTGCATGACTGACTACGTAGCTAGCCGTTAGCTAACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCACTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACTGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC

16. Quais são as aplicações da PCR? • Diagnósticos moleculares • Identificação e isolamento de genes • Marcadores moleculares • Expressão gênica • PCR em tempo real

17. Diagnóstico molecular – gripe aviária

18. Diagnóstico molecular – meningite e penuemonia bacteriana

19. HIV

20. Aplicações • Teste de Identificação de indivíduos • polimorfismo

21. Aplicações expressão gênica e polimorfismo Polimorfismo p53 MELANOMAS DE MUCOSA ORAL E CUTÂNEOS

22. Elementos da PCR DNA amostra, DNA polimerase, Termociclador – substitui a helicase e DNTP – nucleotideos trifosfatados

23. Componentes da Reação: * DNA (DNAg, DNAc* Taq polimerase* Primers* Tampão* MgCl2* dNTPs

24. Qual a importância de oligos Ou primers bem desenhados? Pré requisito para obter sucesso no PCR * alta eficiência * maior sensibilidade * produtos de PCR especificos * ausência de co-amplificação com DNA genômico

25. Avaliação prévia da sequência alvo Observar: * significado biológico (mRNA/cDNA x gDNA) * sequência única * qualidade da sequência alvo * evitar regiões não desejadas na sequência alvo

27. Etapas da PCR 1. Desnaturação 2. Anelamento 3. Extensão

28. Principio da PCR

30. Termocicladores

31. Amplificação Exponencial

32. Ao sair do termociclador a aparência é a mesma – revelação da região amplificada http://teach.genetics.utah.edu/

33. Quantificação do DNA amplificado Nanodrop (espectofotômetro)  260 nm

34. Trabalhando com PCR convencional 1. Etapas Pré- PCR: Coleta da Amostra Estabilização Extração do Ácido Nucleico 2. PCR ou Ciclagem: Preparo da Reação Termociclagem 3. Pós-PCR: Análise em Gel

35. Tipos de PCR Hot Start In situ Inverse Long Multiplex Nested Competitive Touchdown Degenerate Fast

36. Hot Start PCR A enzima DNA polimerase pode demonstrar uma pequena atividade à temperatura ambiente, durante a montagem do experimento E isso pode catalisar a extensão da extremidade 3` Levando depois a degradação da extremidade 5`pois a DNA pol possui atividade exonuclease Destruindo o primer e o substrato Hot Start permite a inibição da atividade da polimerase durante o preparo da reação A polimerase esta ligada a anticorpos e não funciona a temperatura ambiente O aumento da temperatura libera os ac monoclonais e a reação se inicia

37. In situ PCR (ISH) Reação de PCR que ocorre dentro da célula numa lâmina Pode ser realizado em células ou tecidos fixados Útil para acompanhar infecções

38. Inverse PCR (IPCR)c DNA cortado em pequenos fragmentos por enzimas de restrição Ligação do produto – DNA circular DNA novamente tratado com enzimas de restrição – gera produtos com sequencia interna conhecida, que pode ser usada na PCR PCR é realizada com primers complementares às sequências internas conhecidas

39. Long PCR PCR cuja extensão é mais longa que as PCR convencionais (> 5Kb) Enzima amplifica alvos maiores (alta fidelidade!) Objetivos: - Clonagem de cDNA de longos transcritos - Mapeamento de sequências - PCR de genoma mitocondrial

40. Multiplex PCR PCR com dois ou mais conjuntos de primers, para amplificação de diferentes fragmentos de uma mesma amostra Objetivos: - identificação de vários vírus - identificação de deleções em genes em doenças degenerativas (Distrofia muscular de Duchenne)

41. Nested PCR É uma variação da PCR convencional, na qual são utilizados dois paraes de primers (ao i nvés de um) para amplificar um mesmo fragmento Duas PCR: primeira com a fita parental, em seguida em uma segunda PCR com a fita menor Aumenta a especificidade!

42. Competitive PCR É adicionada a reação uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA (competidor) Esse competidor deve conter sequências para os mesmos primers utilizados para amplificar o alvo Quantidade de Dna alvo pode ser derterminada pela razão Alvo (T) / competidor (C)

43. Touchdown PCR Modificação da PCR convencional que pode resultar na diminuição de amplificações não especificas Temperatura de anelamento - começa mais alta que e temperatura ótima dos primers - diminuição de 1C a cada um ou dois ciclos, até atingir a temperatura específica - após atingir essa temperatura ela é mantida nos ciclos restantes Objetivo: Aumentar a especificidade, evita amplificação errônea 95C 30s 95C 30s, 60C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos) 95C 30s, 56 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos) 95C 30s, 53 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos) 95C 30s, 50 C 30 s, 72 C 1min (25 ciclos) 72C 5 min

44. Degenerate PCR O que são primers degenerados? Primers que possuem um numero de opções em várias posições na sequência Exemplo: 5´- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3´ A+C+G =V C+T= Y A+C+G+T= N Objetivo: avaliar polimorfismo

45. Fast PCR Kits específicos (ex. GeneAmp Fast PCR Master Mix) PCR pode ser realizado de forma mais rápida, para algumas aplicações, tais como: - genotipagem de animais transgênicos - PCR de colônia

46. Limitações da PCR convencional * Intensa padronização * Baixa sensibilidade e resolução * Curta extensão dinâmica (< 2 logs) * Colorações não quantitativas * Contaminação (brometo) * Discriminação baseada soemnte no tamanho do amplicon * Não automatizado * Necessidade de pós processamento do produto da PCR

48. Real-time PCR with the SYBR® Green I dye. O corante torna-se fluorescente (diamantes verdes) quando se liga a dupla fita de DNA

49. Real-time PCR with TaqMan® primers O corante torna-se fluorescente (diamantes verdes) quando se liga a dupla fita de DNA

50. HR-1TM Melt Curve A única curva isolada ilustra um declínio mais rápido da fluorescência,indicando uma mutação que pode ter interrompido o pareamento de bases de nucleotídeos do DNA