โครงการ ศึกษาวิจัยวงศ์วิวัฒนาการพันธุกรรมของเชื้อเลปโตสไปโรซิสในสัตว์และคน

1. โครงการ ศึกษาวิจัยวงศ์วิวัฒนาการพันธุกรรมของเชื้อเลปโตสไปโรซิสในสัตว์และคน ผู้วิจัยหลัก นางสาวปานแก้ว รัตนศิลป์กัลชาญ* นักวิชาการสาธารสุข 7 ว. สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 6 จังหวัดขอนแก่น

2. ผู้วิจัยร่วม คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น รศ.ดร.สุรศักดิ์ วงศ์รัตนชีวิน รองศาสตราจารย์ 9 ศูนย์วิจัยและพัฒนาการสัตว์แพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ(ตอนบน) ท่าพระ นายสัตวแพทย์พิเชฐ ทองปัน นายสัตวแพทย์ 6 สำนักงานปศุสัตว์ จังหวัดขอนแก่น นายสัตวแพทย์นพดล วรธงชัย นายสัตวแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลหนองสองห้อง นายแพทย์เกษม ภัทรฤทธิกุล นายแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลศูนย์ขอนแก่น นายแพทย์ธนชัย พนาพุฒิ นายแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลชุมแพ นายแพทย์อุทัย อุโฆษณาการ นายแพทย์ 9 วช โรงพยาบาลมัญจาคีรี นายแพทย์ครรชิต เจิมจิตรผ่อง นายแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลเขาสวนกวาง นายแพทย์จักรพบ ป้อมนภา นายแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลสมเด็จพระยุพราชกระนวน แพทย์หญิงอัมพร รัตนปริญญา นายแพทย์ 8 วช โรงพยาบาลชุมแพ นายแพทย์จันทรโท ศรีนา นายแพทย์ 6

3. ความเป็นมา โรคเลปโตสไปโรซิสเป็นโรคติดต่อระหว่างสัตว์สู่คนเกิดจากเชื้อLeptospira interrogans ซึ่งเป็นเชื้อสไปโรซิสขนาดเล็ก ผู้ป่วยมีอาการแสดงที่แตกต่างกันออกไป ซึ่งอาการของโรคนี้คล้ายคลึงกับโรคอื่นๆอีกหลายชนิด จึงเป็นการยากที่จะวินิจฉัยโรคนี้โดยอาศัยอาการทางคลินิกเท่านั้น จึงจำเป็นต้องอาศัยการตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อยืนยันการวินิจฉัยโรค

4. ความเป็นมา จากงานวิจัยอื่นๆ ไม่สามารถระบุแหล่งรังโรคในสัตว์ที่เป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดโรคในผู้ป่วยได้อย่างชัดเจน และถึงแม้ว่าจะมีการฉีดวัคซีนแต่จะมีผลต้านทาน serovar นั้นๆแต่ไม่สามารถป้องกันการติดเชื้อจาก serovars อื่นได้ ดังนั้นในปี 2546 สำนักงานป้องกันควบคุมโรคติดต่อที่ 6 จังหวัดขอนแก่น ได้รับงบประมาณสนับสนุนการดำเนินงานวิจัยจาก คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น:โครงการบริหารวิชาการการวิจัยเพื่อแก้ปัญหาสุขภาพของประชาชนในภาคตะวันออกเฉียงเหนือในเขต 6 ศึกษาวิจัยค้นหาแหล่งรังโรคในสัตว์ที่ทำให้เกิดโรคในคนโดยดูวงศ์วิวัฒนาการทางพันธุกรรมของเชื้อในคนและในสัตว์ โดยใช้การวินิจฉัยเทคนิคทางอณูชีววิทยา(Molecular biology) โดยมีทีมปศุสัตว์จังหวัดร่วมดำเนินการเก็บตัวอย่างเลือดในสัตว์

5. วัตถุประสงค์ 1.เพื่อหาชนิดเชื้อก่อโรคในคนและสัตว์ด้วยวิธีทางห้องปฏิบัติการ 2.เพื่อศึกษาหาความสัมพันธ์ของวงศ์วิวัฒนาการของเชื้อเลปโตสไปโรซิสในสัตว์และคน โดยวิธี PCR

6. ประโยชน์ที่จะได้รับจากการวิจัยประโยชน์ที่จะได้รับจากการวิจัย 1. พบแหล่งรังโรคของสัตว์ที่เป็นรังโรคที่แท้จริงของการเกิดอุบัติการณ์โรคเลปโตสไปโรซิส 2. ลดอุบัติการณ์การเกิดโรคเลปโตสไปโรซิส :อัตราตายลดลง ทราบชนิดเชื้อก่อโรคในคนและในสัตว์

7. สถานที่ศึกษาวิจัยและระยะเวลาศึกษาวิจัยสถานที่ศึกษาวิจัยและระยะเวลาศึกษาวิจัย ประชากรกลุ่มตัวอย่างในคนและสัตว์ภูมิลำเนาในจังหวัดขอนแก่น ได้แก่ 1. อำเภอเมือง 2. อำเภอหนองสองห้อง 3. อำเภอชุมแพ 4. อำเภอเขาสวนกวาง 5. อำเภอกระนวน 6. อำเภอมัญจาคีรี โดยผู้ป่วยอาชีพเกษตรกรเข้ารับการรักษาโดยได้รับการวินิจฉัยจากแพทย์ และสัมภาษณ์จากแบบสอบสวนโรคว่าป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิสโดยติดเชื้อในพื้นที่

8. กลุ่มประชากรที่จะศึกษา - เพศ : ประชากรศึกษาทั้งเพศหญิงและเพศชาย - วัย : อายุมากกว่า 18 ปีขึ้นไป ลักษณะ: ประชากรที่มีสติสัมปชัญญะสมบูรณ์และมีอาการเข้านิยามขององค์การอนามัยโลกว่าสงสัยว่าป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิส และไม่มีโรคอื่นแทรกซ้อนซึ่งอาจมีผลทำให้ผู้ป่วยเกิด Hb หรือ Hct ต่ำ (คัดกรองตามเกณฑ์องค์การอนามัยโลก และมีแพทย์ผู้ร่วมวิจัยควบคุมดูแลผู้ป่วย)

9. ขั้นดำเนินการ 1.แพทย์เมื่อพบผู้ป่วย เข้าหลักเกณฑ์ว่าป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิสและติดเชื้อในพื้นที่ โดยจะทำการอธิบายและขออนุญาตผู้ป่วยเจาะเลือด เมื่อได้รับการยินยอมแล้ว จะให้ผู้ป่วยลงลายมือชื่อในแบบแสดงความยินยอมเป็นหลัก 2. เจ้าหน้าที่ลงรายละเอียดในแบบส่งตัวอย่าง แล้วเจาะเลือดจากผู้ป่วยจำนวน 2 ครั้งละ 4มล. ห่างกัน7- 14 วัน: โดยครั้งแรกให้เจาะเลือดทันทีที่พบผู้ป่วยเข้าหลักเกณฑ์ว่าป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิสและครั้งที่สองถ้าได้รับการยืนยันทางห้องปฏิบัติการว่าติดเชื้อเลปโตสไปโรซิสจะเจาะหลังจากเริ่มป่วยได้ 14-30 วัน 3. หยดเลือดผู้ป่วยลงในหลอดเพาะเลี้ยงเชื้อ 2 หลอด หลอดที่ 1 = 1 หยด หลอดที่ 2 = 2 หยอด

10. ระยะที่ 2 เมื่อพบผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันจากการตรวจหาโรคเลปโตสไปโรซิส โดยทำการทดสอบ Microscopic Agglutination teas (Lysis) test (MAT) ว่าป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิส สำนักงานป้องกันควบคุมโรค 6 จังหวัดขอนแก่นประสานงานสำนักงานปศุสัตว์จังหวัดขอนแก่นเพื่อประสานกับชุดปฏิบัติการในพื้นที่ โดยสำนักงานปศุสัตว์จังหวัดขอนแก่นและชุดปฏิบัติการในพื้นที่ ประสานกับกำนันผู้ใหญ่บ้านในพื้นที่ประกาศ ประชาสัมพันธ์ และนัดหมายการเข้าไปในหมู่บ้าน ตำบล หาพื้นที่ที่ผู้ป่วยทำกิจกรรม เพื่อเก็บตัวอย่างเลือดในสัตว์

11. การศึกษา molecular typing และ phylogenic หลังจากสามารถเพาะเชื้อได้แล้ว ก็จะทำการสกัด DNA จากเชื้อและนำ DNA ไปทำ molecular typing ด้วยวิธี random amplification of polymaphic DNA (RAPD), (4, 9), arbitrarily prime PCR (AP-PCR) (7, 8), ribotyping (5, 6), AFLP (Amplified fragment length polymorphism) (9), PFGE (Pulse field gel electrophoresis) (3), MRSPs (Mapped restriction site polymorphisms) (8), และ PCR-RFLP (10).และเลือกวิธีที่ดีที่สุดในการแยกมาศึกษา phylogenic analysis

12. ข้อพิจารณาด้านจริยธรรม จัดให้เจ้าหน้าที่อธิบายรายละเอียดของโครงการ ผู้ป่วยมีสิทธิเลือกที่จะเข้าหรือไม่เข้าร่วมโครงการตามความสมัครใจ ผู้เข้าร่วมโครงการต้องลงลายมือชื่อเป็นหลักฐาน ผู้ที่ไม่สามารถลงลายมือชื่อได้ ต้องได้รับความเห็นชอบจากผู้ปกครองก่อน เจาะเลือดโดยเจ้าหน้าที่สาธารณสุขที่มีความชำนาญด้วยอุปกรณ์ปลอดเชื้อที่ใช้ครั้งเดียวทิ้งโดยสอบถามถึงโรคประจำตัวผู้ป่วยก่อน หากมีปัญหาเรื่องโรคเลือดไหลไม่หยุดจะยกเว้นไม่เจาะเลือดผู้ป่วยรายนี้ เก็บตัวอย่างเลือดครั้งละ 4 มล. อาจมีรอยช้ำเล็กน้อยบริเวณที่เจาะเลือดแต่ไม่มีผลกระทบต่อระบบไหลเวียนโลหิตของผู้ป่วย เลือดที่ได้ จะใช้ในโครงการเท่านั้น ไม่ใช้ในวัตถุประสงค์อื่น

13. รายละเอียดการดำเนินงานสำหรับเจ้าหน้าที่รายละเอียดการดำเนินงานสำหรับเจ้าหน้าที่ แพทย์ได้วินิจฉัยผู้ป่วยว่าสงสัยป่วยเป็นโรคเลปโตสไปโรซิส ให้ผู้ป่วยอ่านหรืออ่านเอกสารคำแนะนำหรือแจ้งข้อมูลแก่ผู้ถูกวิจัยหรือผู้อนุญาต ให้ผู้ป่วยลงนามในหนังสือยินยอมเข้าร่วมโครงการด้วยความสมัครใจ เก็บข้อมูลผู้ป่วยใน แบบบันทึกข้อมูลผู้ป่วย โครงการวิจัยตามแบบฟอร์มส่งตัวอย่างงานวิจัยเลปโตสไปโรซิส

14. รายละเอียดการดำเนินงานสำหรับเจ้าหน้าที่รายละเอียดการดำเนินงานสำหรับเจ้าหน้าที่ เจาะเลือดด้วยวิธีการปลอดเชื้อ ปั่นแยกซีรั่มเก็บไว้ที่ อุณหภูมิ -4 องศาเซลเซียส หยดเลือดลงในหลอดเพาะเลี้ยงเชื้อ คลายเกลียวฝาหลอดเพาะเลี้ยงเชื้อเล็กน้อย ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ทุกวันศุกร์ นำส่งศุนย์วิจัยและพัฒนาการสัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบน

15. การตรวจโรคเลปโตสไปโรซิสด้วยวิธีเพาะเชื้อการตรวจโรคเลปโตสไปโรซิสด้วยวิธีเพาะเชื้อ ตัวอย่าง เลือด : เพาะเชื้อ 2 หลอด ใส่เลือดในอาหารเลี้ยงเชื้อ หลอดละ 1, 2, หยด เลี้ยงเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อ EMJH ที่มี fluorouracil 100-200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็น selective medium ที่อุณหภูมิ 30 C เป็นเวลา 1 สัปดาห์-4 เดือน *ไว้ในอุณหภูมิห้อง 30 C Dark field microscope 1 -2 wk interval serotyping ฝ่ายภูมิคุ้มกันวิทยาคลินิก สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข

16. โครงการผ่านคณะกรรมการจริยธรรมโครงการผ่านคณะกรรมการจริยธรรม • ผ่านคณะกรรมการจริยธรรมและอนุมัติให้ดำเนินการเมื่อวันที่ 22 มิถุนายน 2551 • ผู้วิจัยหลักได้จัดประชุมชี้แจงการดำเนินงานร่วมกับทีมวิจัยหลักเมื่อวันที่ 11 กรกฏาคม 2551 • วันที่ 22 พฤศจิกายน 2251 สำนักจัดการความรู้เร่งรัดการใช้งบประมาณให้เสร็จสิ้นภายในเดือนมีนาคม 2551 เพื่อส่งเงินงบประมาณที่เหลือคืนแก่กองคลัง

17. ผลการดำเนินงาน • เก็บตัวอย่างเชื้อเลปโตสไปโรซิสในคน แพทย์ของโรงพยาบาลได้คัดกรองและห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาลได้ส่งตัวอย่างที่ได้คุณภาพตรวจหาเชื้อเลปโตสไปร่า และเพาะเลี้ยงเชื้อที่ ที่ศูนย์วิจัยและพัฒนาการสัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบน จำนวน 69 ตัวอย่าง • ผลการตรวจพบตัวอย่างที่สงสัยว่ามีเชื้อเลปโตสไปร่าจำนวน 5 ตัวอย่าง • ไม่ทราบสถานะของโครงการว่าจะสามารถดำเนินการต่อได้หรือไม่เนื่องจากการเก็บตัวอย่างดำเนินการเพียง 6 อำเภอ และการเก็บตัวอย่างไม่สามารถบอกได้ว่าจะได้ตัวอย่างอีกเท่าไหร่ • การเก็บตัวอย่างในสัตว์ต้องใช้งบประมาณจำนวนมาก และต้องรอผลการตรวจตัวอย่างในคน

18. ทีมวิจัยจึงหารือกันแล้วว่าเนื่องจากโครงการไม่เสถียรภาพด้านการเงิน และการเก็บตัวอย่างเป็นการดำเนินงานในคน ไม่สามารถจะบอกได้ว่าจะได้จำนวนตัวอย่างอีกจำนวนเท่าใด • จึงขอยุติโครงการ

19. ประวัติยาวนานของโครงการประวัติยาวนานของโครงการ • ในปี 2546-2547 ได้ปรึกษา ทีมงานและจนท.สสจ ขอนแก่น ให้ จนท สถานีอนามัยเก็บตัวอย่างเลือดให้ • ปี 2547 - 2549 ส่งจริยธรรมกรรมการวิจัยในคนของ กรมการแพทย์ • ปี2550 ได้งบประมาณ 50,000 บาท • ปี 2551 ได้รับงบประมาณ 100,000 บาท ผ่านจริยธรรมกรม คร เดือนมิถุนายน 2551

20. ปัญหาอุปสรรค ปี 2546-2549 • เจ้าหน้าที่ผู้ปฏิบัติงานในพื้นที่เก็บตัวอย่างเลือดผู้ป่วยมีการเปลี่ยนแปลงโยกย้ายทำให้บางแห่งเมื่อมีเจ้าหน้าที่ใหม่เข้ามาแต่ไม่ทราบเรื่องการดำเนินงานวิจัยจึงไม่ได้รวบรวมตัวอย่างไว้ให้ จากการประสานงานไปยังพื้นที่ทำให้ต้องประสานงานกับสาธารณสุขอำเภอให้ติดตามและเป็นรวบรวมตัวอย่างเลือดนำมาส่งที่สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 6 จังหวัดขอนแก่น และทำรายละเอียดการดำเนินการติดไว้ทุกหน่วยงานเพื่อให้สามารถดำเนินการได้แม้จะไม่เจ้าหน้าที่คนเดิม • เจ้าหน้าที่ที่ดำเนินการเจาะเลือดและเก็บตัวอย่างและผู้นำส่งตัวอย่างเลือดไม่เข้าใจวิธีการเก็บตัวอย่างเลือดทำให้เลือดที่นำมาหาเชื้อเลปโตสไปร่าไม่พบเนื่องจากเลือดเสียและเพาะเลี้ยงเชื้อไม่ได้ จึงได้ดำเนินการแก้ไขโดยจัดทำแผนผังการดำเนินงานอย่างละเอียดไว้ทุกแห่ง

21. การเพาะเลี้ยงเชื้อเลปโตสไปร่ายากมากและใช้เวลานานจึงได้ประสานศูนย์วิจัยและพัฒนาการสัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบนร่วมดำเนินการเพาะเลี้ยงเชื้อ(อยู่ในระหว่างการหาวันประชุมเพื่อกำหนดแนวทางในการดำเนินงานร่วมกันในเดือนธันวาคม 2547) • ปศุสัตว์จังหวัดติดภาระกิจหลักโรคไข้หวัดนกจึงประสานงานศูนย์วิจัยและพัฒนาการสัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบนเป็นผู้ร่วมดำเนินการและช่วยประสานงานในพื้นที่

22. ปี 2551 • ปรับปรุงการดำเนินงานของโครงการ โดยให้ห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาล และผู้อำนวยการโรงพยาบาลช่วยดำเนินการ • ปัญหาและอุปสรรค • ได้รับงบประมาณ 100,000 บาท มีค่าตอบแทนแก่เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการตัวอย่างละ 200 บาท แต่ไม่มีค่าตอบแทนให้แพทย์ที่ทำหน้าที่คัดกรองผู้ป่วยของโรงพยาบาล(เสียงวิจารย์ที่ได้รับมาหลังจากติดตามตัวอย่างเลือด) เจ้าหน้าที่ห้องแลปรอแพทย์สั่งก่อนเจาะเลือดผู้ป่วย • ขออุปกรณ์ส่งตัวอย่าง • ขอค่าน้ำมันรถในการนำส่งตัวอย่างมายังศูนย์วิจัยฯ

23. ปี 2551 • ปรับปรุงการดำเนินงานโดยให้ห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาล และผู้อำนวยการโรงพยาบาลช่วยดำเนินการ • ปัญหาและอุปสรรค • ได้รับงบประมาณ 100,000 บาท มีค่าตอบแทนแก่เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการตัวอย่างละ 200 บาท แต่ไม่มีค่าตอบแทนให้แพทย์ที่ทำหน้าที่คัดกรองผู้ป่วยของโรงพยาบาล(เสียงวิจารย์ที่ได้รับมาหลังจากติดตามตัวอย่างเลือด) เจ้าหน้าที่ห้องแลปรอแพทย์สั่ง

24. ปัญหาและอุปสรรค (ต่อ) • เจ้าหน้าที่โรงพยาบาล ไม่ดูแลหลอดเพาะเลี้ยงเชื้อตามเอกสารการดำเนินงานที่ให้ไว้ ทำให้หลอดเพาะเลี้ยงเชื้อเน่าเสียไปบางส่วน • ผู้ร่วมวิจัยบางท่าน(แพทย์จากโรงพยาบาลบางแห่ง)ได้ส่งตัวอย่างที่ไม่ใช่ของงานวิจัยไปที่ศูนย์วิจัยและพัฒนาการสัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบนเพื่อขอรับการตรวจแต่ไม่นำมาเป็นข้อมูลของงานวิจัย

25. ปัญหาและอุปสรรค • งบประมาณของหน่วยงานราชการมีความสลับซับซ้อนในการใช้จ่าย นักวิชาการหากไม่มีประสบการณ์ หรือไม่ศึกษาให้ดีจะมีปัญหา เช่นงานวิจัยเลปโตเขียนในโครงการว่าเป็นโครงการต่อเนื่องสองปี แต่ฝ่ายแผนและฝ่ายการเงินบอกว่าให้เขียนขอปีต่อปี การเงินบอกว่าทำได้แต่ถึงเวลาจริงๆที่กองคลังเรียกเงินคืน ก็ช่วยให้คำแนะนำอะไรไม่ได้ จะติดต่อกองคลังหรือ สำนักจัดการความรู้เองก็ไม่ได้ต้องผ่านกรรมการวิจัย สคร ฝากถามไปมาหลายครั้ง • ในอดีตการเขียนของบประมาณงานวิจัย มีปัญหาเรื่องการแบ่งเค้กให้งานวิจัยอื่นๆได้ดำเนินการด้วย เนื่องจากกรมตัดงบให้ สคร เป็นเงินก้อน งบได้น้อย ต้องหาเครือข่ายช่วย

26. อนาคต (ไม่ท้อ) • นักวิชาการเครือข่ายเฝ้าระวังป้องกันควบคุมโรคติดต่อระหว่างสัตว์และคนในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ ได้ศึกษาข้อมูลของการเกิดโรคเลปโตสไปโรซิส กอร์ปกับภาวะโลกร้อนทำให้ภูมิอากาศเปลี่ยนแปลงไปจะทำให้เกิดโรคเลปโตสไปโรซิสระบาดใหญ่ได้อีกในอนาคตข้างหน้า สิ่งที่ปัจจัยเอื้อต่อโรคเลปโตสไปโรซิส คือ เป็นโรคที่มีความสัมพันธ์ระหว่างคน สัตว์ และสิ่งแวดล้อม ซึ่งยากต่อการควบคุม ในอนาคตผู้วิจัยอาจจะของบประมาณดำเนินงานวิจัยอีกครั้งจากศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีแห่งชาติ (ศกว) ซึ่งสามารถให้งบประมาณจำนวนมากได้ • แต่ขณะนี้หน่วยงานปรับปรุงเข้าระบบแท่งเงินเดือน และขอมูลจากหัวหน้ากลุ่มโรคติดต่อทั่วไปบอกว่าการดำเนินงานวิจัยใช้เงื่อนไขว่าต้องผ่าน วช เท่านั้นจะนำมาเป็นตัวชี้วัดของ สคร เหมือนกับว่าถ้าได้งบประมาณจากที่อื่นจะไม่ได้เครดิต เซรงค่ะ

27. คำแนะนำ • ทำงานวิจัยเล็กๆ และหาวิธีการให้การดำเนินงานต่อเนื่อง • เน้นการเก็บตัวอย่างให้ถูกต้องกับโรคที่ศึกษา โดยการดำเนินงานต้องเน้นการเก็บตัวอย่างที่ถูกต้อง ให้ตรงกับฤดูกาลระบาดของโรค • ใช้งบประมาณจากแห่ลงไหนก็ได้แต่ต้องผ่านคณะกรรมการจริยธรรมของกรมควบคุมโรค