Получение рекомбинантных белков как этап создания лечебно-профилактических препаратов

1. Получение рекомбинантных белков как этап создания лечебно-профилактических препаратов М. И. Потапович БГУ, Минск 2011 г.

2. Биофармацевтический рынок(C.L. Barton, 2010) • Мировой рынок биофармацевтической продукции в 2010 г. составил около $100 млрд. • К 2015 г. – более $170 млрд. (65% - рекомбинантные белки) • В сегменте негликозилированных рекомбинантных белков первую позицию занимает интерферон ($4 млрд. к 2014 г., из них альфа-интерферон – $1,5 млрд.)

4. Этапы создания препаратов на основе рекомбинантных белков Получение продуцента Культивирование (ферментация) Отделение целевого продукта Создание лекарственной формы Определение специфической активности Очистка рекомбинантного белка

5. Характеристики различных типов экспрессионных систем

6. Накопление свиного (A) и куриного (B) ИФН-αв клетках E. coli BL21 (λDE3) и E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL A. B.

7. A. B. A.Структурная часть гена куриного ИФН-α B.Структурная часть гена свиного ИФН-α Цветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотные кодоны. AGG/AGA/CGA– аргинин, CTA– лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин

8. Посадка праймеров при замене редких кодонов в структурной части гена свиного ИФН-α

9. Схема синтеза гена свиного ИФН-αпри замене редких кодонов agg → cgt aga → cgt ccc→ ccg gga → ggcСтадия 1 (матрица – тотальная ДНК, выделенная из крови) Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4

10. A. A.Структурная часть гена лошадиного ИФН-α B.Структурная часть гена бычьего ИФН-γ Цветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотные кодоны. AGG/AGA– аргинин, CTA– лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин B.

11. Codon Adaptation Index (CAI) CAI – величина, показывающая частоту использования кодонов в данном гене относительно частоты использования кодонов в референсном наборе генов Ген куриного ИФН-α: CAI = 0,435 Ген свиного ИФН-α: CAI = 0,330 Ген свиного ИФН-α с заменой редких кодонов = 0,544 Ген лошадиного ИФН-α: CAI = 0,340 Синтетический ген бычьего ИФН-γ: CAI = 1,0 (Расчет с использованием программы CodonW (J. Peden))

12. Накопление лошадиного ИФН-α (A) и бычьего ИФН-γ (B) в клетках E. coli BL21 (λDE3) A. В.

13. А. А.Тельца включения в клеткахE.coli (S. Betts, 1998) В. Электронная микрофотография клетокE. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL-pIP2403 (трансмиссионный электронный микроскоп Philips CM120 BioTwin), выращенных без индукции ИПТГ С. Электронная микрофотография клетокE. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL-pIP2403 послеиндукции 0,5 ммоль/л ИПТГ в течение 3 часов В. С.

14. Бычий ИФН-α (А) после очистки из телец включения (5 стадий) и бычий ИФН-γ (B), очищенный из супернатанта после разрушения клеток (1 стадия) A. В.

15. Видоспецифичность интерферонов Интерферон птиц≠ Интерферон КРС

16. Рекомбинантные α-интерфероны • Интерферон + витамины • Гиповитаминозы • Вирусные заболевания • Иммуномодулятор • Интерферон + антибиотики (Гентаферон, Линкоферон и др.) • Смешанные инфекции • Иммуномодулятор • Субстанция интерферона рекомбинантного • Вирусные заболевания • Иммуномодулятор • Стрессовые состояния

17. Действие ИФН в составе препаратов И, возможно, самое главное! 14 – многократное усиление антибактериального действия антибиотиков, снимая при этом их иммунодепрессирующий эффект на организм животного 1 - противовирусный эффект; 2 - подавление роста и развития внутриклеточных инфекционных агентов невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие); 3 - увеличение лизоцимной активности сыворотки крови; 4 – увеличение бактерицидной активности сыворотки крови; 5 – антитоксическое и антистрессовое действие; 6 – радиопротективный эффект; 7 – стимуляция макрофагов и усиление фагоцитоза; 8 – усиление продукции антител; 9 – активизация естественных киллерных клеток; 10 – усиление синтеза простагландинов; 11 – стимуляция освобождения гистамина базофилами; 12 – усиление формирования антигенов ГКГ; 13 – подавление гиперчувствительности замедленного типа;

18. Спасибо за внимание