第六章 酶蛋白的化学修饰

1. 第六章 酶蛋白的化学修饰

2. 一、酶的化学修饰 • 1、概念 • 凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白质（酶）共价结构发生改变，从而改变蛋白质（酶）的某些特性和功能的过程都可称蛋白质（酶）的化学修饰。

3. 2、酶的化学修饰的目的和意义 • ①目的： 　　构象优化、结构稳固 • 1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 • 2． 作用的最适条件不符。 • 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 • 4． 临床应用的特殊要求。 • ②意义： A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性半衰期短）

4. B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如：酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物抑制）B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如：酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物抑制） • C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性等)、扩大酶的应用范围）

5. 3、酶修饰途径 • （1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的酶蛋白（蛋白质工程）。 • （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择性化学修饰）。

6. 三． 酶化学修饰的基本原理 • 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 • 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 • 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境

7. 四、酶蛋白修饰的方法 • （1）酶分子的表面修饰： • 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定（即共价固定化酶）；

8. 2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的表面基团；（如：对酶分子的侧链基团，尤其酶活性中心的必需基团进行化学修饰）2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的表面基团；（如：对酶分子的侧链基团，尤其酶活性中心的必需基团进行化学修饰）

9. 3）大分子修饰 • 非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; • 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖层.

10. 4）分子内交联：增加酶分子表面基团相互交联，稳定酶分子；4）分子内交联：增加酶分子表面基团相互交联，稳定酶分子；

11. 5）分子间交联：用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶5）分子间交联：用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶

12. 6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改善稳定性和免疫性；6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改善稳定性和免疫性；

13. 7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂中加表面活性剂与酶形成含水分子的反相胶团，酶分配在团内的水性环境中，使酶与有机相分开，避免酶变性。7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂中加表面活性剂与酶形成含水分子的反相胶团，酶分配在团内的水性环境中，使酶与有机相分开，避免酶变性。

14. （2）酶分子内部修饰 • 1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变酶动力学性质和酶亲和能力； • 2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； • 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代，即化学突变法； • 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具有某种活性的构象；

15. 二、化学修饰的机理 • ①酶蛋白质功能基团的可反应性； • ②修饰剂的可反应性。 SH-CH2-CH2OH

16. (一)影响酶蛋白功能基团反应性的因素 • 1、基团定位因素 • 蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。

17. 2、蛋白质局部微区性质的影响 • 功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的，而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团的pK有影响。

18. （1）微区的极性 • 微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。 • 如：乙酸在水中的pK为4．76，在80％乙醇中增至6．87，在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK升高。

19. 卵清溶菌酶中第35号谷氨酸的-C00H在25℃时的pK为5.9，而当溶菌酶与其抑制剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此pK则升至6.4。卵清溶菌酶中第35号谷氨酸的-C00H在25℃时的pK为5.9，而当溶菌酶与其抑制剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此pK则升至6.4。 • pK的提高可能是由于这个残基的微区极性降低之故。 ● 35

20. 提示：局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小；对氨基和组氨酸反应性的影响较大；对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大。提示：局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小；对氨基和组氨酸反应性的影响较大；对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大。

21. （2）氢键效应 • 天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是使pK发生改变的一个因素。 • 例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基形成氢键的能力比溴强。 • 水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。

22. （3）静电效应 • 不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。 • 碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基团相互影响所致。

23. （4）位阻效应 • 处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位阻效应。 • 如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被修饰。

24. （二）酶蛋白功能基团的超反应性 • 超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速反应的能力。 • 蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相比，反应性要差。 • 但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶活性部位上的基团。

25. 影响超反应性的因素： • ①改变蛋白质功能基团的pK值； • ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； • ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； • ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性； • 超反应性由一个或几个因素的综合作用而产生。

26. （三）修饰剂反应性的决定因素 • 蛋白质的构象和表面特性对接近氨基酸侧链功能基的修饰剂也产生有利或不利的影响。因而对修饰剂也提出了一定的要求。

27. 1、选择吸附性； • 化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选择性地吸附在蛋白质低或高极性区的。 • 如：D-氨基酸氧化酶的巯基宜与N-烷基马来酰亚胺的反应，因为巯基的辛基化速度比乙基化速度高15倍。说明巯基处在非极性环境中。修饰剂先与蛋白质的巯基疏水键合，然后烷基化。 • 二硝基氟苯修饰牛血清白蛋白时，二硝基氟苯先与其疏水键合。

28. 2、静电相互作用： • 带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。 • 静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基的一侧定位。

29. 3、位阻因素； • 蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。

30. 4、催化因素； • 修饰部位附近的其他功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异。 • 如对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的丝氨酸乙酰化机理相同，但后者反应性差。

31. 5、局部环境的极性： • 许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关。情况比较复杂。

32. 三、设计酶化学修饰的要点 1、了解酶的性质 对酶的活性部位、酶的稳定条件、酶反应最适条件及酶的侧链基团等到的了解。

33. 2、选择修饰剂的类型 • 修饰剂的分子量、链的长度、对蛋白质的吸附性；修饰剂上反应基团的数量和位置；修饰剂上反应基团的活化方法与条件。 • 一般要求修饰剂具有较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、修饰剂分子表面有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。

34. 3、选择修饰反应的条件 • 尽量少破坏酶活性功能的必需基团。反应体系中酶与修饰剂的分子比例；反应体系的溶剂性质、盐浓度和pH条件；反应温度及时间。

35. 四、常用的化学修饰剂 ①糖及糖的衍生物： • 主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖等。 　②高分子多聚物： • 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG) • 聚乙烯(polyvinyl alcohol，PVA) • 聚N-乙烯吡咯烷酮(poly（N-vinylpyrrolidone，PVP) • 聚顺丁烯二酸酐、聚丙烯酸(polyacrylicacid，PAA) 。

36. ③生物大分子： 常用的有肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸类等。 • ④双功能试剂： 主要有戊二醛、二异硫氰酸、二胺类等。 • ⑤其他 ： 常用的修饰剂还有某些固定化酶载体、糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂及某些小分子有机物等。

37. 五、化学修饰的措施 • 酶的化学修饰基本原则： • 充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经过一定的活化过程与酶分子中的某些基团或辅因子产生化学反应，对酶分子结构进行改造。

38. 1、修饰酶蛋白侧链基团 • 酶分子中的可解离基团如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等，都是可以被修饰的基团。

39. 修饰酶蛋白侧链基团举例 • （1）对巯基的修饰： • 烷化剂：如碘乙酸、碘乙酰胺、巯基乙醇、谷胱甘肽等。 E-SH+ICH2COOH（或ICH2CONH2）→E-S-CH2COOH（或E-S-CH2CONH2）+HI • （2）对氨基的修饰 • 乙酸酐修饰： E-NH2+CH3COOCOCH3 →E-NHCOCH3 + CH3COOH

40. （3）羧基的化学修饰O NR • 羰二亚胺反应： ∥ ∥ • E-COO-+R-N=C=NHR` →E-C –O-C-NR` • （4）咪唑基的修饰反应 • 碘代反应： • E-咪唑基+ICH2COO- → E-咪唑基- CH2COO-+ HI

41. （5）吲哚基的化学修饰 • 4-硝基苯硫氯反应： • E-吲哚基+CIS-苯环-NO2→ E-吲哚基-S-苯环-NO2+HCL • （6）二硫键的化学修饰 • 2-巯基乙醇修饰： • S • E + SH-CH2-CH2OH→SH-E-S-S- CH2-CH2OH • S

42. 酶蛋白侧链经修饰后，可以稳定酶分子的催化活性，提高抗变性的能力。酶蛋白侧链经修饰后，可以稳定酶分子的催化活性，提高抗变性的能力。 • 如超氧化物歧化酶(SOD)，作为药物在体内的半衰期仅为6～10min，影响其药用效果。 • 用聚乙二醇、右旋糖酐、聚蔗糖分别对SOD分子上的Lys的ε-NH2进行修饰后，所得到的修饰酶在血液中的半衰期可从原来的6-10min增加到几小时，甚至达35h；

43. 2、酶分子内或分子间进行交联 • 应用某些双功能交联剂如戊二醛、聚乙二醇等可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分进行共价交联。 • 如：用聚乙二醇修饰后的过氧化氢酶，抗蛋白水解酶的能力有明显增加而且抗原性消失。

44. 3、修饰酶的辅因子 • 对于依赖辅因子的酶，可将辅因子共价结合在酶上或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子； • 如：对于金属酶中的金属离子可以采取置换的办法来改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。 • 如羧肽酶A的活性部位中的锌被钴取代后，原有的酯酶活力和肽酶活力都增加；在淀粉酶中用钙取代其他金属离子也能使酶的稳定性提高。

45. 4、酶与大分子化合物相结合 • 酶与某些蛋白质、多糖等高分子化合物结合后，可以增加其稳定性。 • 如α-淀粉酶在65℃时的半衰期仅为25 min，用右旋糖酐修饰后，其半衰期可增加到63min。

46. 5、肽链的有限水解 • 肽链的一部分水解后有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位。 • 如用胰蛋白酶对天冬氨酸酶进行有限水解切去10个氨基酸后，酶的活力提高了5.5倍。说明天然酶并不总是处于最佳构象状态。

47. 六、修饰酶的特性 • 酶分子经过化学修饰后，其特性在一定程度上发生改变，天然酶的一些不足之处可以得到改善。

48. 1、热稳定性提高 • 原因1:修饰剂共价连接于酶分子后，使酶的天然构象产生一定的“刚性”，不易伸展失活，并减少了酶分子内部基团的热振动，从而增加了热稳定性。这种热稳定性效果和修饰剂与酶之间的交联点的数目有关。（PEG和酶以单点交联时热稳定性提高并不明显，通常交联点增多，酶的热稳定性就可提高）

49. 原因2:修饰剂本身增加了酶分子的表面亲水性，使酶分子在水溶液中形成新的氢键和盐桥。原因2:修饰剂本身增加了酶分子的表面亲水性，使酶分子在水溶液中形成新的氢键和盐桥。 • 如α-胰凝乳蛋白酶的表面氨基经乙醛酸修饰，再还原成亲水性更强的-NHCH2COOH后，在60℃时热稳定性提高了1000倍，这种稳定的酶可用于医药和洗涤工业。