实验三、 DNA 的重组

1. 实验三、DNA的重组 【实验目的】 • 学习体外重组DNA的技术方法和原理。

2. 【实验原理】 • 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2＋、ATP存在的连接缓冲系统中，将经过酶切的或脱磷酸处理的载体分子与外源DNA分子进行连接。这样经过重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

3. 限制性酶切割DNA形成黏性末端

4. 连接与转化示意图

5. DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连接为一体的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个具有平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连接为一体的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个具有平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

6. T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步： • 首先，T4连接酶与辅助因子AMP形成酶-AMP复合物； • 然后，酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化； • 最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。重组的DNA分子是在T4 DNA连接酶的作用下，有Mg2＋、A TP存在的连接缓冲系统中，将酶切后的DNA分子和载体连接。

7. DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过CIP（牛小肠碱性磷酸酶）处理克服。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过CIP（牛小肠碱性磷酸酶）处理克服。 • 连接反应的温度在37度时有利于连接酶的活性，但在这个温度下，粘性末端的氢键结合不稳定。因此人们找到了一个折中温度，即12至16度连接过夜，这样既可最大限度的发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

8. 【仪器与试剂】 一、仪器 1、恒温烘箱 2、恒温水浴箱 二、试剂 1、10×T4 DNA 连接酶 Buffer 2、ddH2O

9. 【实验步骤】 在1.5ml EP管中，建立如下反应体系（总反应体积20µl）： • DW：6µl • 10×T4 DNA 连接酶 Buffer：2µl • 纯化的PCR产物：10µl • pUCm-T Vector：1µl • T4 DNA 连接酶：1µl 混匀，室温连接过夜。

10. 【思考题】 • 在进行连接反应时，应如何设置对照组？ • 如何提高连接的效率？