1. Immunohistokemi Cecilia Ottosson Laboratoriemetodik, grundläggande, vt14 Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin

2. Litteratur • Cellularpathology - kap 10, 13 • ImmunohistochemicalStainingMethods (finns i pingpong) - kap 1, 2, 3, 8, 9 och 17

3. Immunohistokemi • Identifiering av vävnadskomponenter med hjälp av antikroppar • Immunohistokemi – vävnadsprover Immunocytokemi – cellutstryk • Antigener, ag - epitop • Antikroppar, ak – Immunoglobuliner (Ig) -plasmaceller (B-lymfocyt) -IgG, IgM

4. Immunohistokemi • Polyklonala antikroppar - immunisering av värddjur - ak mot ett flertal olika epitoper • Monoklonala antikroppar -hybridomteknik -högt specifika, riktade mot endast en epitop

5. Immunohistokemi • Bindning ag-ak - samverkan mellan jonbindningar, vätebindningar, Van der Waals krafter och hydrofoba bindningar • Visualisering av ak - markörer - kovalent bindning - konjugering, biotinylering

6. Markörer • Enzymer - horseradishperoxidas (HRP) - alkaliskt fosfatas (AP) • Horseradishperoxidas - substrat: väteperoxid - PRP: syre - kromogen: DAB (diaminobenzidin) AEC (aminoetylkarbazol) • Alkaliskt fosfatas - substrat: α-naftolfosfat - PRP: : α-naftol - kromogen: diazosalter (Fast Red) Substrat  primär reaktionsprodukt (PRP) PRP + kemiskt ämne  slutlig reaktionsprodukt (SRP) SRP – olöslig (precipitat)

7. Markörer • Fluorescerande molekyler - FITC, Texas Red - fluorescensemikroskop - nackdel: speciellt mikroskop mörkt rum svårt att orientera sig bleknar med tiden • Metaller - guld, silver - vid elektronmikroskopi • Biotin - avidin - ej visualisering!

8. Ospecifik bakgrund • Ospecifik inbindning av ak - inkubering med proteinlösning innan ak - normalserum • Endogent enzymaktivitet - peroxidas – väteperoxid - alkaliskt fosfats - levamisol • Endogent biotin - avidin

9. Korsreaktioner • Ak reagerar med en snarlik epitop på annat ag • Ak korsbinder till varandra

10. Spädning av ak • Optimal spädning – högsta spädningen på ak som ger stark färgningsreaktion med låg bakgrundsfärgning • Högre affinitet – lägre koncentration (hög spädning) • Affinitet – dragningskraften/bindning mellan ak-ag • ”Smarta” spädningar

11. Inkubering • Tid • Temperatur • Fuktig kammare

12. Avmaskering • Formaldehydfixerat, paraffininbäddat material • Fixering – maskering av antigen • Enzymatisk behandling - proteolytiskaenzymer (trypsin, proteinase K) - kritisksteg: tid förkorttid – ejtillräckligavmaskering förlångtid – tar bort antigen • Värmebehandling - mikrovågsugn, tryckkokare - citratbuffert, EDTA-buffert

13. Metoder i ett och två steg • Direkt metod - endast en ak - akmärkt med markör - fördel: snabbmetod - nackdel: lågsensitivitet • Indirekt metod - omärktprimärak - märktsekundärakriktad mot primärak - fördel: känsligaremetod, merekonomisk - nackdel: långsammare

14. Metoder i tre steg • PAP – peroxidas-anti-peroxidas • APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas • ABC – avidinbiotin komplex • LSAB – labelledstreptavidinbiotin

15. Enzym-anti-enzymkomplex • PAP – peroxidas-anti-peroxidas APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas • Naturlig affinitet hos en antikropp mot ett antigen (här: enzym) - omärkt primär ak - sekundär ak – ”bro” - enzym-anti-enzymkomplex - substrat och kromogen

16. Avidin-biotin • ABC (avidin-biotin-komplex) LSAB (labelledstreptavidinbiotin) • Avidins höga affinitet mot biotin - omärkt primär ak - sekundär biotinylerad ak - avidin-biotin/avidin konjugerat med enzym - substrat och kromogen

17. Immunogold • Ej naturligt i kroppen - primär omärkt ak - sekundär ak märkt med guldpartikel - om ljusmikroskopi: intensifiering med silver - om elektronmikroskopi: olika storlekar på guldpartiklarna → dubbelinfärgning

18. Polymerkonjugerade system • Dextranmolekyl • Direkt metod - ex EPOS (Enhanced Polymer One-Step Method) • Indirekt metod - ex Envision

19. Kontroller • Vävnadskontroller - positiv - negativ • Blank

20. In situ hybridisering • Lokalisering på vävnad • Märkta DNA strängar – fluorescense (FISH) kromogen (CISH) silver (SISH)

21. In situ hybridisering • Små mängder prober • DEPC, EDTA, formamid, NaCl • Förbehandling: - avmaskering av DNA - blockering av ospecifik inbindning