Cours Spectrométrie de Masse

1. Cours Spectrométrie de Masse L’ionisation par électropray : l’ESI Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Cours ESBS Octobre 2005 Tel: 03 90 24 27 78 ssangli@chimie.u-strasbg.fr

2. Prix Nobel de chimie 2002 From the official Nobel press release : « Mass spectrometry is a very important analytical method used in practically all chemistry laboratories the world over. Previously only fairly small molecules could be identified, bur John B. FENN and Koichi TANAKA have developed methods that make it possible to analyse biological macromolecules as well ».

3. L’ionisation par électropray : l’ESI Deux méthodes d’ionisation des biomolécules particulièrement efficaces et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment améliorées : le MALDI et l’ESI (ElectroSpray Ionisation). L’ESI a les caractéristiques suivantes : - nécessite une introduction de l’échantillon en solution - génère des ions multichargés (analyse de protéines) - fonctionne à pression atmosphérique - souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe d’ions. Publications originales: (1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B. Anal. Chem. 57, 675-679 (1985) 2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, 1702-1708, (1989)

4. L’ionisation électrospray : principe de la production du spray Tube capillaire Débit imposé par une pompe 0 volt Champ électrique qui agit sur le liquide chargé + 2000 volts ………… Effet de pointe qui entraîne la déformation du liquide en gouttelettes chargées + 3000 volts Emission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés. Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe.

5. Electrospray: Formation de gouttelettes chargées sous l’effet d’un champ électrique

6. ………… + + + + + + + + + ++ ++ Evaporation du solvant L’ionisation électrospray : mécanisme de formation des ions Émission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes: 1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution 2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites 3- « transfert » des ions en phase gazeuse  Réduction de taille, mais nombre de charges électriques constant (explosions coulombiennes)

7. ………… L’ionisation électrospray : émission des ions en phase gazeuse L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes: 1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution 2- fissions des gouttelettes chargées en « gouttelettes filles » plus petites 3- « transfert » des ions en phase gazeuse: 2 modèles Emission des ions en phase gazeuse 1- Le modèle de Dole (charged residue model): Fission jusqu’à obtenir un seul ion par gouttelette (Dole et al. J. Chem. Phys. 1968, 49, 2240-2249) 2- Le modèle d’Iribarne et Thomson (ion evaporation model) A partir de gouttelette de moins de 10nm il y a extraction directe des ions (Thomson et al. J. Chem. Phys. 1979, 71, 4451-4463)

8. L’ionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité ………… Débit de la pompe Débit du spray L’électrospray est concentration – dépendant • Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la sensibilité. • L’intensité du courant d’ions produit dépend de la concentration de la solution et non pas du débit auquel la solution est injectée • Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible possible

9. ………… L’ionisation électrospray : débit élevés et débits faibles Débit de la pompe Débit du spray Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de solution apporté par la pompe. • DEBITS ELEVES (1 - 200 microlitres par minute) • En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. • DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute) • Plus l’orifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible. • Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il n’est même plus nécessaire de pousser avec une pompe; l’aspiration électrostatique suffit à assurer le débit (nano spray)

10. ………… Flux d’azote comprimé ………… L’ionisation électrospray : pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la nébulisation (1 à 200 microlitres /min.) Débit de la pompe Débit de la pompe Capillaire d’environ 100 microns de diamètre intérieur Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. Des gouttelettes sont arrachées à la surface du cône de liquide.

11. Le système de "canne" d'introduction ESI Extrémité de canne d'introduction MICROMASS, montrant le capillaire en quartz qui amène le solution (75 microns de diamètre intérieur). Le gaz de nébulisation(azote) est améné de façon concentrique par le tube en métal. La tension de 3 à 4000 volts est appliquée sur le métal. Le tube de quartz ne doit dépasser que de 0,5mm.

12. Le système de "canne" d'introduction ESI

13. L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min. ………… Débit de la pompe (Nano LC-MS) Débit du spray: de 0,1 à 1 µL/min MICRO SPRAY : capillaire de faible diamètre (20 à 75 microns) …….………… Débit du spray: de 1 à 200 nanoL/min NANO-SPRAY : selon Mann et al. Orifice réduit (1 à 3 microns) 1 - 4 mm D’autres nano-systèmes automatisés permettent des débits de quelques nano-litres par minutes (Advion,…)

14. L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min. Capillaire nanospray vide E spray instable E correct spray stable E trop faible

15. ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - L’ionisation par électronébulisation est de nature électrolytique Elle est basée sur un processus électrolytique : H2O H+ + OH- Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante Solution Cône de Taylor SM D Capillaire métallique (appauvri en électrons) e- Cône Contre électrode Générateur de haute tension Certains OH- sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH-OH. Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables.

16. H2O H+ + OH- Excès de protons + Perte d’un électron : oxydation L’ionisation par électronébulisation est de nature électrolytique Avec un voltage positif sur le capillaire on génère des gouttelettes chargées positivement à cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables. Vers la pointe du capillaire Solution chargée Solution neutre ++- +-++- ++- +-+- +-+-+- +-+- Solution neutre OH . Radical neutre et réactif

17. - - - - + - + - - + + + + + - + - + + + - - - - - - - - - - - L’ionisation par électronébulisation est de nature électrolytique Elle est basée sur un processus électrolytique : H2O H+ + OH- Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante Solution Cône de Taylor SM D Capillaire métallique (enrichi en électrons) e- Cône Contre électrode Générateur de haute tension Certains H + sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique : H +H. Avec un voltage négatif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées négativement à cause d’un déficit de protons des sites déprotonables.

18. L’ionisation électrospray : Règles d’ionisation des biomolécules en ESI - Ionisation positive (le voltage de source est positif) : Elle se fait souvent par protonation d’un site basique, par exemple sur un acide aminé comme K, R, (H) -NH3+ -NH2 - Ionisation négative (le voltage de source est négatif): Elle se fait par perte d’un proton, par exemple sur un acide aminé comme D, E L’ionisation négative est moins sensible que le mode positif. Souvent utilisée pour DNA et RNA -COO- -COOH Les peptides et protéines contiennent de nombreux groupes basiques ou acides qui peuvent recevoir des charges positives ou négatives

19. L’ionisation par électrospray permet la mesure de masse de molécules très grosses. • Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions multichargés. • Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z élevée. • La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses monoisotopiques.

20. 100 % m/z 0 Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES On se sert des profils isotopiques z charges 500.5 501.5 502.5 m/z Dm/z=1 La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da donc le rapport m/z varie de 1/z Si z=1 Dm/z=1 z=2 Dm/z=0.5 z=3 Dm/z=0.33 etc

21. Peptide Scan ES+ 843.59 3.86e8 100 844.46 % 845.45 0 m/z 826 830 834 838 842 846 850 854 858 862 866 822 Les difficultés du calcul de la masse moléculaire par ESI-MS: La résolution est ici suffisante pour mesurer le pic monoisotopique Les paramètres utilisés pour le programme informatique de recherche des sommets des pics détermineront si la mesure donnée portera - sur le centroïde du pic 843,59 (on obtiendra la masse monoisotopique) ou - sur le centroïde du massif isotopique entier (on obtiendra la masse moyenne, ou chimique).

22. Spectre ESI d’un peptide de masse monoisotopique 1340,6 Da avec résolution isotopique sur les ions à une et deux charges Massif isotopique Dichargé (différence de 0,5 m/z) Massif isotopique monochargé [M + 2H] 2+ [M + H] +

23. Massif isotopique d’ions à 4 charges Différences de 0, 25 m/z Spectre ESI d’un peptide avec les ions à 3, 4, 5 et 6 charges. Masse monoisotopique : 2098,0 Da 5+ 4+ 6+ 3+

24. Peptide Scan ES+ A3 A2 100 361.19 A: 1080.47±0.07 541.21 % 374.77 0 m/z 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Calcul de la masse moléculaire par ESI-MS Le cas d’un peptide de 9 acides aminés où 3 états de charges sont observés Cette mesure donne la masse moyenne. La résolution instrumentale, et les paramètres utilisés pour détecter les centroïdes des pics ne permet pas la détection des sommets des pics isotopiques. Spectre ESI du peptide RLRAPLQQV(C47 H85 N17 O12 ) Masse moyenne calculée à partir de la séquence peptidique : 1080.283 Da Masse monoisotopique calculée à partir de la séquence peptidique : 1079.645 Da

25. Scan ES+ A2 100 A A: 1000.08±0.05 501.07 1001.03 % 0 m/z 500 600 700 800 900 1000 1100 Calcul de la masse moléculaire par ESI-MS pour les peptides Importance de la résolution instrumentale: en fonction de celle-ci, on mesure la masse moyenne (chimique) ou la masse monoisotopique. Ce spectre présence la position des centroïdes (mode « stick ») Le cas d’un peptide de 9 acides aminés où 2 états de charges sont observés. Spectre ESI du peptide GLVVENQEL (C43 H73 N11 O16 ) Masse moyenne calculée à partir de la séquence peptidique : 1000,116 Da Masse monoisotopique calculée à partir de la séquence peptidique : 999,585 Da

26. La détection du profil isotopique dépend de la résolution de l’analyseur (Ex de la myoglobine) 17+ On mesure la masse monoisotopique R = 30000 Si réso Si pas de réso R = 2000 On mesure la masse moyenne

27. Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: L'ESI génère des ions multichargés La masse M et le nombre de charge z sont d’abord calculés à partir de 2 pics. Ensuite, M est calculée à partir de chacun des pics de la série d’ions multichagés. Dans cet exemple on observe 15 états de charges différents (10 à 24 charges). La masse mesurée sera donc le résultat de la moyenne de ces 13 mesures, d’où la grande précision obtenue. A: 16951.47 ± 0.28 Da Série d’ions multichargés. Tous ces pics correspondent à la même molécule, mais avec un nombre de protons différents.

28. X1 X2 m/z M + z1 mH M + z2 mH X1 = X2 = z1 z2 z2 = z1 - 1 Système de 2 équations à 2 inconnues Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut d’abord déterminer les valeurs de z Deux pics consécutifs permettent de déterminer M et Z1 A: 16951.47 ± 0.28 Da X2 - 1 Calcul de Z: z1 = X2 - X1

29. M + z1 = 893.205 X1 = z1 M + z2 X2 = = 942.742 z2 Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut d’abord déterminer les valeurs de z X1 X2 A: 16951.47 ± 0.28 Da X2 - 1 942.742 - 1 z1 = 19 19.01 z1 = = = Calcul de Z: X2 - X1 942.742 – 893.205

30. Calcul de la masse moléculaire de la myoglobine à partir de la série d’ions multichargés du spectre ESI m/z z Masse 679,12 25 16953,00 707,31 24 16951,44 737,99 23 16950,77 721,5 22 15851,00 808,28 21 16952,88 848,53 20 16950,60 893,24 19 16952,56 942,67 18 16950,06 998,18 17 16952,06 1060,41 16 16950,56 1130,95 15 16949,25 1211,81 14 16951,34 Moyenne : 16951,65 +/- 0,17 Da Une fois que les valeurs de z sont déterminées (en résolvant le système d’équation à 2 inconnues M et z), la masse moléculaire de la protéine est recalculée à partir de chaque pic. La moyenne des valeurs trouvées pour la masse moléculaire est calculée avec une déviation standard. Plus il y a d’ions multichargés, plus la masse pourra être mesurée avec précision Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques

31. Transform Myo Scan ES+ 100 A 16952.63 . % 0 Masse 12000 13000 14000 15000 16000 17000 19000 18000 Un artifice de présentation : la transformation d’un spectre ESI d'ions multichargés en spectre avec échelle de masse vraie. Les intensités absolues de tous les ions multichargés (en m/z) de la myoglobine sont additionnées pour donner un pic de masse moléculaire chimique

32. Théoriquement, la largeur des pics d’ions multichargés devrait être équivalente à celle du massif isotopique

33. Théoriquement, la largeur des pics d’ions multichargés devrait être équivalente à celle du massif isotopique En réalité, ce n’est pas le cas car: - la résolution de l ’analyseur n ’est pas suffisante - la présence d ’adduits de sels élargit les pics: remplacement d ’un ou plusieurs protons par des ions Na+ ou K+ de façon aléatoire si la résolution ne permet plus de séparer les pics des ions de ceux des ions+adduits, la masse mesurée est faussée Il faut donc dessaler l’échantillon avant analyse: étape limitante si le composé à analyser est insoluble en - chromatographie liquide en phase inverse l’absence de sels - dialyse

34. Pour les masses moléculaires élevées, la largeur des pics est au moins celle du massif isotopique. Spectre ESI d'une antitrypsine recombinante (Transgene, Strasbourg)

35. Avec une source ESI, l'analyseur peut être: • Un quadrupôle Le moins cher et le plus facile • Une trappe d'ions MS-MS facile et pas cher • Un temps de vol Meilleure résolution qu'un quadrupôle • Un appareil magnétique Difficile et cher, mais 20000 de résolution • Un FT-ICR Cher, difficile et lent, mais très haute résolution

36. L’interface entre la source ESI et l’analyseur:Comment passer de 1 atmosphère à 10-6 millibar? Pour faire passer les ions formés à pression atmosphérique dans l’enceinte sous vide de l’analyseur du spectromètre de masse, il faut un dispositif appelé INTERFACE Interface Analyseur Source 1 atm 10-6 mbar 10-1 mbar Pression atmosphérique (milieu visqueux) Pompage puissant Vide poussé (libre parcours moyen élevé) Transmission etfocalisation des ions Obtention d ’ions en phase gazeuseà pression atmosphérique Séparation des ions en fonction de m/z

37. Le rôle de l'interface est de guider les ions vers l'analyseur Les ions, formés à pression atmosphérique, sont entraînés au travers d'une série d'orifices de 0,2 à 0,3 mm de diamètre. Pour résister à l'entraînement du pompage on utilise un guide d'ions hexapôlaire Interface Hexapôle ……… Spray Vers l'analyseur Pression atmosphérique Premier pompage: 1-7 mbar Deuxième pompage: 10-3 mbar Pompage de l'analyseur: 10-6 - 10-7 mbar

38. ………… ………… Pour faire chuter la pression : 2 cônes ou 1 capillaire et un cône Autre rôle de l’interface : transmettre les ions et désolvater les ions Vc (5 à 200 volts) -x volts 0 volts 3000 volts Cône 2 Cône 1 -x volts 0 volts -x volts Vc 0 volts Capillaire Cône

39. Le système d'orifices côniques de l'interface ESI.

40. a. Un problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc b. Différents types d’interfaces existent Les valeurs optimales de Vc pour la désolvatation ne sont pas identiques sur toutes les interfaces commerciales. a. Interface Micromass b. Interface Finningan c. Interface Vestec c.

41. Schéma d'un ESI-Q-Q (Micromass), appareil MS-MS Contre-électrode (0,1 à 1 kV) Skimmer lens-offset (-20 à +20 V) skimmer (0 à 2V) Capillaire (2 à 4 kV) Cône d’extraction (Vc = 0 à 200 V) N2 (gaz de séchage) hexapôle (0 à 1 V) quadripôle Système d’introduction T = 40 à 120 °C N2 (gaz de nébulisation) 1bar 0,7 à 1 mbar 10-3 mbar 10-6 mbar SOURCE Analyseur INTERFACE Schéma d’un spectromètre de masse de type Bio-Q (Micromass). Le spray n'est pas orthogonal au premier cône, mais est dans l'axe

42. Schéma d'un ESI-TOF (Micromass), appareil MS simple. Cône d’échantillonnageVc(5-200 V) Cône d’extraction (0-10 V) ‘Bafle’ Lentilles de focalisation Capillaire d’introduction (3 kV) Détecteur MCP ‘pusher’ Hexapôles 1 Hexapôles 2 TOF Jauge Pirani Pi Pompe à palettes Pompe Turbo Pompe Turbo Pompe Turbo Réflecteur P (mbar) 1013 2,5-7 10-3 5,2 x 10-7 Source Interface Analyseur TOF Le spray est orthogonal à l'axe du premier cône, ce qui facilite l'élimination des neutres

43. Les rôles de l'hexapôle, qui se trouve dans le 2eme étage de l'interface, sont multiples : 1- Il maintient les ions dans le champs hexapolaire et les guide vers l'analyseur. 2- Il rassemble les ions dans l'axe de la trajectoire et en fait un faisceau bien fin (focalisation spatiale). 3- Il force les ions à osciller, de façon synchrone, dans le champs hexapôlaire (focalisation en énergie). Le faisceau d'ions est ainsi focalisé en énergie (homocinétique) et focalisé dans l'espace, ce qui permettra à l'analyseur de fonctionner dans les meilleures conditions

44. Refocalisation des ions par les hexapoles Refocalisation en direction Refocalisation en énergie cinétique

45. Le rôle de l'interface est de guider les ions vers l'analyseur Système de guide d'ions hexapolaire dans son support (Agilent)

46. Un 1er problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc (voltage de cône). Le règlage Vc de l'INTERFACE est essentiel en ESI. • L'interface permet de conférer aux ions une énergie interne variable, grâce aux chocs que subissent les ions dans le premier étage de l'interface. • La possibilité de doser l'énergie interne des ions permet de désolvater les ions. • La possibilité de doser l'énergie interne des ions permet d'induire des fragmentations des ions dans l'interface même, avant que les ions ne pénètrent dans l'analyseur; ceci permet donc d'obtenir des informations de structure (sur des composés purs) sans avoir à faire de MS-MS. • La possibilité de doser l'énergie interne des ions dans l'interface permet de "préchauffer" les ions de façon adéquate avant de les soumettre à des expériences de MS-MS; ceci permet de les rendre plus sensiblez aux collisions en MS-MS.

47. Vc= V volts 0 volts Accélération 3000 volts ………… Analyseur Voltage de cône Electrospray à pression Atmosphérique : milieu visqueux (pas d’accélération) 10-6 mBar 10-1 mBar Un 1er problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc (voltage de cône). • Les ions sont formés par le mécanisme « électrospray » à pression atmosphérique. • L’interface a pour rôle de les transférer de la zone à pression atmosphérique vers le vide du spectromètre de masse. • De plus, après leur formation par électrospray, les ions sont souvent encore partiellement solvaté; le rôle de l’interface est de les désolvater totalement.

48. V volts 0 volts 3000 volts ………… Un 1er problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc Energie cinétique adaptée M+nH+ Ions désolvatés: la désolvatation a évacué l’énergie interne Ions incomplètement désolvatés, avec des ions salins Zone de chocs qui confère une énergie interne aux ions Accélération Voltage de cône

49. V volts 0 volts 3000 volts ………… Un 1er problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc Energie cinétique insuffisante M+nH+ Ions incomplètement désolvatés, avec des ions salins Zone de chocs qui confère une énergie interne aux ions Une série d’adduits Accélération Voltage de cône

50. Un 1er problème clef en ESI: le passage des ions au travers de l’interface grâce à Vc Une désolvatation insuffisante génère des spectres difficiles à interpréter. La résolution permet de distinguer chaque « adduit » La résolution ne permet de distinguer chaque « adduit »