Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), UNLP-CONICET.

1. La Plata, 7 de Junio de 2007 “TRATAMIENTOS NO TERMICOS DE INACTIVACION DE SEROTIPOS DE Escherichia coli RELACIONADOS CON EL SUH EN ALIMENTOS LIQUIDOS” 1ra Jornada SINDROME UREMICO HEMOLITICO Dra. LEDA GIANNUZZI Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), UNLP-CONICET. Cátedra de Toxicología y Química Legal, UNLP

2. Las frutas se encuentran expuestas a la contaminación microbiana tanto en su cosecha, como en su transporte y comercialización. • En los jugos, el riesgo de contaminación con bacterias patógenas como las E. coli productoras de toxina shiga (STEC) es elevado, debido principalmente a: 1) La capacidad de muchos serotipos, de sobrevivir en alimentos de bajo pH y 2) La elevada prevalencia de varios serotipos en alimentos, en el mundo y en Argentina. • Los serotipos de E.coli productores de toxina shiga (STEC), asociados a enfermedades en humanos se denominan E.coli enterohemorrágicos (EHEC). • Escherichia coli O157:H7 es el prototipo de un grupo de más de 100 serotipos (O26:H11; O103:H2; O111:NM; O121:H19; O145:NM; entre otros) que comparten el mismo potencial patogénico. • EHEC: Asociado con Síndrome Urémico Hemolítico (SUH).

3. Durante la reunión realizada en octubre de 2006, el Grupo de Trabajo de Criterios Microbiológicos de la CONAL discutió respecto a la probable incorporación de las STEC del serotipo no-O157 al CAA, alcanzando las siguientes conclusiones: Argentina presenta una incidencia elevada de SUH. En el año 2005, la tasa de notificación fue de 13,9 casos/100.000 niños menores de 5 años, la más alta del mundo. Cepas STEC no-O157 se detectan en aproximadamente el 25% de los casos de SUH en el país. Cepas STEC no-O157 son detectadas en reservorios animales y en alimentos, representando el 95% y 60%, respectivamente, del total de las cepas STEC detectadas. Algunos serotipos de STEC no-O157 detectados en alimentos fueron asociados a SUH en Argentina y en otras partes del mundo. Por lo tanto, es importante la inclusión de STEC no-O157 a los criterios microbiológicos de productos cárnicos del CAA a los efectos asegurar la calidad microbiológica de los alimentos destinados a la población, previniendo el SUH. Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar

4. La principal vía de transmisión de STEC O157 y no-O157 son los alimentos contaminados. La contaminación de los alimentos se debe principalmente al contacto con las heces del ganado bovino. Aunque... Se demostró que el 50,8% de los rumiantes silvestres del Jardín Zoológico y Botánico de La Plata portaban STEC, incluyendo el aislamiento de STEC O146:H28 (asociado con enfermedad en humanos) de un roedor autóctono, lo que sugiere que estos podrían ser portadores y eventuales transmisores de este patógeno. (Leotta y col, 2006. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in captive non-domestic mammals. Veterinary Microbiology Vol 118(1-2): 151-157) Otras formas de transmisión incluyen el contacto directo del hombre con los animales, la contaminación cruzada durante la preparación de alimentos, y la transmisión persona a persona por la ruta fecal-oral.

5. Como llegan las STEC a las frutas ?????

6. Efecto destructivo sobre enzimas y la posibilidad de generar cambios en el valor nutricional, así como en las propiedades sensoriales Según el Codex: JUGO DE FRUTA Líquido sin fermentar, pero fermentable, que se obtiene de frutas en buen estado, debidamente maduras y frescas o frutas que se han mantenido en buen estado por procedimientos adecuados La industria comercial de jugos se inicia en 1869 con el embotellado de jugo de uva por la compañía Welch de (N.J.) Esta industria introdujo el principio de conservación mediante pasteurización, lo que permite elaborar productos de larga vida útil

7. Los jugos de fruta no pasteurizados, son seguros??? pH ácido... Es suficiente ??

8. Jugos de fruta sin pasteurizar pueden presentarse como un potencial vehículo de transmisión de STEC

10. * 1996: Washington, California, Colorado: 70 afectados. Consumo de jugo de manzana no pasteurizado. Causas: * Recolección de manzanas caídas a la tierra contaminada con heces de ciervos. Entrada de los animales a zonas frutales + Contaminación de manzanas caídas + Lavado insuficiente de manzanas + Extracción y envasado del jugo + Consumo de jugo no pasteurizado + Supervivencia de E. coli a pH bajo = Infección

11. Tecnologías no térmicas de conservación de alimentos

12. Surgen en el contexto donde los consumidores valoran características de los alimentos que les confieren mayor valor añadido como son: Una escasa manipulación La conservación de características sensoriales y nutricionales propias del alimento fresco + Seguridad microbiológica !!!

13. En el 2002, la FDA propone la implementación de un plan de HACCP para la producción de jugos y derivados. Dentro de dicho plan, sugiere la aplicación de tratamientos alternativos a la pasteurización capaces de lograr reducciones de 5 ciclos logarítmicos. HACCP http://www.cfsan.fda.gov/~comm/haccpjui.html

14. Altas Presiones

15. Fundamento: Sometimiento del producto a una elevada presión hidrostática (200 - 900 MPa ó 2.000–9.000 atm), desde minutos hasta algunas horas Fluido transmisor: agua Ventajas: Transmisión isostática y casi instantánea de la presión a todos los puntos del alimento Destrucción de microorganismos Inactivación enzimática Mantenimiento de vitaminas, aromas y sabor Producto entero Puede modificar la textura y/o funcionalidad del alimento Limitaciones: Alto costo Limitaciones con algunos envases

16. El alimento se somete a presiones uniformes entre 2000 y 9000 atm. Donde encontramos estas presiones? 1 Pascal = 1 N/m2 1 Pa = 10-5 bar 1 bar = 0.989 atm = 1.03322 kg/cm2

18. 600 kg/h El estudio de los efectos de las altas presiones sobre diversos sistemas data del siglo XIX. El alto costo y las dificultades técnicas de su aplicación industrial impidieron que se empleara en la práctica, en especial en el área de alimentos.

19. * 1 cepa de E.coli O157:H7 * N0= 106-107 UFC/ml * Buffer fosfato (PBS, 1M, pH= 7) y jugo de naranja (pH = 3.8) * Presiones de entre 300-600 MPa durante 20minutos a TºC ambiente

20. a b 3 5 5 3 1 1 Control 200 MPa , 5 pasajes 200 MPa , 1 pasaje Completa ruptura celular Pérdida citoplasmática Poros en la membrana celular Parcial deformación y ruptura celular Reducción (Log) de E.coli O157:H7 ATCC 35150 inoculada en: a) PBS (pH 7); b) Jugo de naranja (pH 3.8), tratada con 1, 3 o 5 pases de 200 MPa. No= 106 UFC/ml; TºC 20ºC Completa inactivación: PBS= 3 y 5 pasajes. Jugo de naranja= 5 pasajes

21. * 3 cepas de E.coli O157:H7 * N0= 106-107 UFC/ml. * Inoculadas en caldo y en leche descremada * Presiones de entre 300-600 MPa durante 20minutos a TºC ambiente

22.  Mayor inactivación en caldo que en leche  Reducciones de hasta 7 log en caldo y hasta 4.0 - 4.2 en leche.  Efecto protector de la leche sobre las bacterias

23. Campos eléctricos pulsados

24. Fundamento: Aplicación de pulsos eléctricos de microsegundos de alta intensidad de campo eléctrico (104 V) en alimentos colocados entre dos electrodos. El equipo incluye un generador de alto voltaje, una cámara de tratamiento, un sistema de refrigeración y un equipo de envasado aséptico, además de los sistemas de control. Ventajas: Tratamiento a baja temperatura Destrucción microbiana Posibilidad de trabajo en continuo Alta eficiencia energética Limitaciones: Alimentos viscosos y homogéneos de tamaño de partícula pequeño (<1cm) Desconocimiento de efectos sobre algunos alimentos

26. N0= 107-108 UFC/ml. Medio de Recuperación= PCA

27. Daño provocado por PEF

28. Radiación Gamma

29. Fundamento: Radiaciones gamma (procedente de cobalto 60). Dosis varían entre 0,075 y 10 kGy según producto. (Directivas 1999/2/CE y 1999/3/CE) Ventajas: Aumento de la temperatura inapreciable No hay pérdidas de nutrientes Destrucción microbiana e inactivación enzimática No deja residuos No se modifican los constituyentes Alta penetración en envases. Tratamiento de palets. Limitaciones: Mala imagen Costo elevado Poco efectivo en líquidos Instalaciones propias

31. “La irradiación es el proceso más estudiado en la historia de la humanidad para asegurar la sanidad de los alimentos” Quién apoya y aprueba la utilización de irradiación? • Organización Mundial por la Salud (OMS) • Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO) • Codex Alimentarius • Administración de Drogas y Alimentos (US Food & Drug Administration---FDA) • Departmento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) • American Medical Association (Asociación Americana de Médicos) • American Dietetic Association • Academia Americana de Pediatría • Cámara Americana en Ciencias y Salud (American Council on Science & Health)

33. * 3 cepas de E.coli O157:H7 * N0= 108-109 UFC/ml. * Cepas adaptadas y no adaptadas previamente a las condiciones ácidas * Inoculadas en 6 lotes de jugo de manzana (diferente absortividad y pH) * Dosis de entre 0-2 KGy. * Temperatura de tratamiento= 2ºC

34. Acido-adaptadas Acido-adaptación de E.coli O157:H7 aumenta la resistencia a la radiación gamma en jugo de manzana. No Acido-adaptadas Resistencia a la radiación gamma es cepa dependiente

35. Resistencia de O157:H7 varía según las características del jugo Relación entre los valores D y la absorbancia de los jugos

36. Radiación Ultravioleta

37. Fundamento: Radiaciones no ionizantes. Fuente: Lámparas de mercurio de alta y baja presión Ventajas: Aumento de la temperatura inapreciable Bajo costo Poca pérdida de nutrientes Destrucción microbiana No deja residuos Efectivo en alimentos líquidos, principalmente aguas Limitaciones: Poca penetrabilidad Poca inactivación enzimática

38. Espectro electromagnético “Región germicida” (Formación de dímeros de T-T, C-C, C-T y U-U; Cambios en las proteínas)

39. Radiación ultravioleta = Es efectiva para inactivar cepas STEC en jugos de fruta ???

40. Concepto de DOSIS Dosis = Intensidad x Tiempo de exposición Joule/cm2 Minutos Cantidad de Energía por unidad de área en mW/cm2

41. 4 Lámparas de baja presión de mercurio (Lux 30W/G30 T8, Phillips) H2= 15cm H1= 40cm Sistema de ventilación Agitador orbital Dosis (E) de UV se determinan con un Radiómetro digital (VLX-3X CE)

42. Visor Digital Célula Fotoeléctica Radiómetro digital (VLX-3X CE)

43. Cual es la supervivencia de cepas STEC en jugo de naranja exprimido ??

44. Resistencia de cepas de E. coli en jugo de naranja es un fenómeno cepa dependiente. Todas las cepas son toxigénicas. = O157:H7 EDL 933; ■= O157:H7 33/98; ▲= O157:H7 303/00; ▼= O157:H7 547/03; = O157:H7 749/03; = O103:H2; ■= O113:H21; ▲= O145:NM; ▼= O26:H11; = ATCC 25922. Medio de cultivo para el crecimiento de sobrevivientes: Agar Triptona Soja (TSA). Cepas cedidas por la Dra. Marta Rivas. Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

45. Cuales son los factores que influyen en la efectividad del tratamiento con UV en la inactivación de E. coli en alimentos líquidos ??

46. Condiciones estudiadas • Alimentos líquidos con diferente coeficiente de absortividad (turbidez) • Cepas utilizadas: O157:H7 EDL 933 y ATCC 25922 • Dosis (E, J/cm2) = Intensidad (I, mW/cm2) x tiempo de exposición (t, seg) Efecto de la I y de la E en la inactivación por UV de E.coli (E= 0 y 8; I= 3.3 y 4.8) • Efecto del inóculo inicial (N0= 106 UFC/ml y 104 UFC/ml) • Efecto del espesor de la película expuesta al UV (0.7mm y 2.8mm) • Efecto de la agitación del sistema (0 y 220 rpm) • Efecto del medio de cultivo empleado para el recuento de sobrevivientes (TSA y SMAC)

47. 2.8 mm sin agitación 2.8 mm con agitación a 0.7mm sin agitación 0.7mm con agitación Cepa E.coli O157:H7 (EDL 933) inoculada en Jugo de manzana estéril Símbolos cerrados Nivel de inóculo inicial 106 CFU/ml Símbolos abiertos= Nivel de inóculo inicial 104 CFU/ml Log N/No = - k E donde k es la constante de inactivación, y E la dosis de UV aplicada La cinética de inactivación es independiente del N0

48. Parámetro D=1/k (Dosis de UV necesaria para reducir la población microbiana en un 90%) Los valores de D resultaron entre 1.2 y 1.8 veces mayores en TSA que en SMAC.

49. Por otra parte.... • Alimentos con mayor coeficiente de absortividad presentaron menor letalidad para ambas cepas de E. coli. • La inactivación por UV depende del producto de la intensidad por el tiempo de exposición, es decir de la dosis (J/cm2). • La agitación del alimento conjuntamente con el menor espesor de la película de líquido (0.7mm) presentó el mayor efecto bactericida. • Se recomienda el empleo de TSA como medio de cultivo para la recuperación de células sometidas a la acción de la radiación UV.

50. 2.8mm (0 rpm) 2.8mm (220 rpm) 0.7mm (0 rpm) 0.7mm (220 rpm) Manzana Naranja Multifruta Igualmente para SMAC y para ATCC 25922 Relación entre coeficientes de absortividad y valores de D obtenidos para E.coli O157:H7 EDL 933. Medio de Cultivo: TSA Relación lineal entre los coeficientes de absortividad y los valores de D para ambas cepas de E.coli.