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第十五章 碳水化合物分析

第十五章 碳水化合物分析. Yangchg@njau.edu.cn. 概 述. 总碳水化合物( 100% ) =100- (水分 + 粗蛋白质 + 粗灰分 + 粗脂肪) %. 总碳水化合物. 有效碳水合物 ——. 单糖、双糖、低聚糖、糊精、淀粉、糖原. 无效碳水合物 ——. 果胶、半纤维素、纤维素、木质素. 糖的分析方法: 物理法 —— 旋光法。 物理化学法 ——3,5- 二硝基水杨酸比色法、钼蓝法、蒽酮比色法、纸层析色谱法、液相色谱法。 化学方法 —— 斐林氏法、高锰酸钾法、碘量法、铁氰化钾法 酶化学分析法。. 第一节 水溶性糖的测定.

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第十五章 碳水化合物分析

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Presentation Transcript


  1. 第十五章 碳水化合物分析 Yangchg@njau.edu.cn

  2. 概 述 总碳水化合物(100%) =100-(水分+粗蛋白质+粗灰分+粗脂肪)% 总碳水化合物 有效碳水合物—— 单糖、双糖、低聚糖、糊精、淀粉、糖原 无效碳水合物—— 果胶、半纤维素、纤维素、木质素 • 糖的分析方法: • 物理法——旋光法。 • 物理化学法——3,5-二硝基水杨酸比色法、钼蓝法、蒽酮比色法、纸层析色谱法、液相色谱法。 • 化学方法——斐林氏法、高锰酸钾法、碘量法、铁氰化钾法 • 酶化学分析法。

  3. 第一节 水溶性糖的测定 澄清剂要求:除去干扰物,不吸附糖,不改变糖比旋光度。 (一) 水溶性糖的提取 • 热水浸提; • 75%乙醇浸提。 • 澄清与除干扰物(蛋白质、氨基酸、多糖与色素)试剂: • 中性乙酸铅——色浅植物性样品; • 碱性乙酸铅——色深样品; • 乙酸锌-亚铁氰化钾——色浅富含蛋白质样品。

  4. 新型无铅沉淀剂 • 碱式氯化铝溶液:称取50g AlCI3·6H2O,溶于适量的水,加入氨水至不再产生沉淀,真空抽滤,以蒸馏水洗涤沉淀至无Cl-,转人三角瓶,加24.5ml l:1盐酸,加热至溶解,最后调整溶液体积为100mL。

  5. (二) 水溶性单糖(还原糖)的测定 1、铜还的直接滴定法——Lane –Eynon’s method • 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 亚甲基蓝指示剂:氧化态为蓝色;还原态为无色。 用标准糖液滴定至无色。 • 方法要点: • 严格按操作要求进行; • “约测”与“精测”; • 滴定要在有水汽保护下进行,防烫伤; • 糖的含量可查表或从标准糖的滴定中求出。

  6. 每毫升浓度为1/5 mol/L K2MnO4质量 2×K2MnO4分子量 10×Cu分子量 X 2×158 158/5 5×63.57 X 2、高锰酸钾容量法——Munson-Walker’s method • 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 可测定Cu2O的量,计算糖的含量。 5× Cu2O + Fe2 (SO4)3+ H2 SO4→CuSO4 + FeSO4 + H2O 10FeSO4+2K2MnO4 +8H2SO4→ 5Fe2 (SO4)3 +2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O 上反应式可知10mol铜相当于2mol高锰酸钾,则每毫升摩尔浓度为1/5 mol/L K2MnO4溶液相当的Cu量(x)为: X=63.6mg

  7. 3、半微量法——Shaffer-Somogy’s method • 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 用H2 SO4酸化时,Cu2O溶解为Cu+。索姆吉试剂中的和与在酸化同时发生如下反应: KIO2 + KI +3 H2 SO4→K2SO4 + 3I2 + 3H2O 试剂中KIO2的是定量加入的,所以生成的I2也是一定量的。生成的I2与Cu+发生氧化还原反应消耗部分I2。 2 Cu++ I2 → 2 Cu2++2 I- 溶液中的I2以淀粉为指示剂用Na2S4O6标准溶液滴定。 I2 +2S2O32- → 2S4O6 2-+2 I- 实验同时做空白试验,则 样品应消耗的Na2S2O3毫升数=V空白-V实测 查表或用标准糖测量值比较计算糖含量。 • 本法适用于含糖量不太高的植物组织样品。

  8. 4、氰化盐碘量法——常量法 • 方法原理 还原糖与已知过量的铁氰化钾碱性溶液作用,生成亚铁氰化钾和糖酸: 糖 + 碱性铁氰化钾 → 糖酸 + 亚铁氰化钾 + H2O 过量的铁氰化钾在HOAc存在下与KI作用,生成游离太的I2: 2[Fe(CN)6] 3- + 2 I-→I2 + 2[Fe(CN)6] 4- 加入硫酸锌,使生成的亚铁氰化钾形成白色沉淀亚铁氰化锌,以利反应进行 。 2[Fe(CN)6] 4- + 2Zn2+→ Zn2[Fe(CN)6] ↓(白色) 溶液中的I2以淀粉为指示剂用Na2S4O6标准溶液滴定。 I2 +2S2O32- → 2S4O6 2-+2 I- 实验同时做空白试验,则 样品应消耗的K3 Fe(CN)6毫升数=V空白-V实测 查表或用标准糖测量值比较计算糖含量。

  9. O= =CH- -CH2OH O 5、蒽酮比色法——微量法 蒽酮试剂 戊糖 浓H2 SO4 糠醛 -H2 O 已糖 羟甲基糠醛 蓝绿色糠醛衍生物 • 方法原理 糖在浓硫酸作用下,可经脱水生成糖醛或羟甲基糠醛,可与蒽酮试剂反应生成蓝绿色的糠醛衍生物,用比色法测定(630nm)。 • 方法评述 • 方法的专一性差,所有糖类均有此反应,注意排除非糖的干扰。 • 不同糖与蒽酮试剂的显色深度不同,显色深浅顺序为:果糖﹥ 葡萄糖﹥半乳糖,甘露糖﹥五碳糖,注意不同糖的组成其显色深度不同。

  10. 6、3,5-二硝基水杨酸法 • 方法原理 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以,所得的结果乘以0.9。 • 方法评述 • 方法的专一性差,所有糖类均有此反应,注意排除非糖的干扰。

  11. 7、苯酚比色法——微量法 • 方法评述 • 方法的专一性差,所有糖类均有此反应,注意排除非糖的干扰。 • 颜色可稳定160min 以上。 • 方法原理 糖在浓硫酸作用下,可经脱水生成糖醛或羟甲基糠醛,可与苯酚试剂反应生成橙红色的化合生生物,10~100mg范围用比色法测定(480nm)。

  12. 8、斐林试剂比色法——微量法 • 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 蓝色的斐林试剂脱色,脱色的程度与溶液中含糖量成正比,可在590nm处比色测定。

  13. 9、砷/磷钼酸比色法 方法原理 还原糖是具有羰基(>C=O)的糖,能将其它物质还原而其本身被氧化。 (1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热,可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子,产生砖红色的氧化亚铜沉淀,其本身被氧化。具体反应如下:

  14. (2)氧化亚铜在酸性条件下,可将钼酸铵还原,还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用,生成一种蓝色复合物(砷/磷)钼蓝,其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量(即被还原的Cu2O 量)成正比,用标准葡萄糖与砷钼酸作用,比色后做标准,就可测得样品还原糖含量。

  15. 0.75  ×100 蔗糖,%= 与100mL溶液相当的样品质量(g) (三) 糖料作物中蔗糖的测定——旋光法 比旋[]20D 指100mL溶液中含100g旋光物质,通过液层厚度(即管长l)为1分米(1dm),在温度为20℃,钠光源(D=589.3nm)偏振面所旋转的角度。蔗糖=+66.5;葡萄糖=+52.8;果糖=-92.8;麦芽糖=+118。 方法原理 糖分子具有不对称碳原子,可使通过的偏振光的偏振面旋转。当光的波长、温度和液层厚度一定时,溶液中蔗糖的浓度与偏振光面旋转角度成正比。 计算 ——偏振光面旋转角度。 0.75=常数K=100/(2× []20D);当糖的浓度以g/100mL表示时。

  16. 第二节 淀粉的测定 (一)淀粉测定待测液的制备 • 酸水解法 • 淀粉糖化酶-酸水解。 淀粉水解的中间产物以及与碘的呈色反应。 淀粉→蓝糊精→红糊精→无色糊精→麦崖糖→葡萄糖 碳链长度: ﹥12 6~12 ﹤6 2 1 • 氯化钙-乙酸浸提-比旋法测定(指定比旋[]20D=203) (二)测定(略)

  17. 第三节 粗纤维的测定 膳食纤维——难以被人分解吸收,但对人健康有重要作用的一类物质。 • 纤维素:由葡萄糖以-1,4糖苷键连接以成的多多糖,是细胞壁的主要成分,可吸持相当于自重15~24%水。耐稀酸,可溶于72%以上浓硫酸并部分水解。 • 半纤维素:指细胞壁中不溶于,可溶于冷稀碱中的多糖;与稀酸共热时,比纤维素易水解。水解产物有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。 • 木质素:复杂芳香族聚合物,不是碳水化合物,但与纤维素伴随。难以被化学或酶法降解,缓慢溶于有机溶剂如二恶烷中。用72%硫酸处理所得不溶性残留物便是木质素。 • 果胶类物质:一种充满细胞间隙、细胞壁间隙的植物胶。 • 粗纤维

  18. 粗纤维测定的方法 • 容量法 • 用2%盐酸溶液除去可溶性糖、淀粉、和半纤维素后,用80%硫酸使纤维素溶解并加热水解为葡萄糖而测定之,再换算为纤维素含量。 纤维素%=葡萄糖%×0.9。 • 酸碱水解法 • 样品脱脂后,分别用稀酸和稀碱处理除支糖及蛋白质,再用丙酮除去单宁、色素和残余脂肪,秘得残渣重减去粗灰分即为粗纤维。 • 酸性洗涤剂法 • 在稀酸溶液中,季胺盐类物质如十六烷基三四基溴化铵(cetyltrimethly ammonium bromide简称CTAB)能有效地除去动力饲料中的蛋白质多糖、核酸等,而纤维素和木质素很少水解。用此溶液水解、洗涤、烘干后所得的植物残渣即粗纤维。

  19. 第四节 果胶物质的测定 • 果胶物质 一种均多糖。由半乳糖醛酸本与鼠李糖所组成的杂多糖,如阿拉伯胶、聚半乳糖、阿拉伯半乳糖等。可作治肠胃溃疡和解重金属中毒药。 • 测定方法 • 质量法——样品经热水浸提后,用氢氧化钠皂化(脱去甲氧基,生成果胶酸钠),加入氯化钙,使其形成果胶酸钙沉淀,沉淀经过滤、烘干后称重,经换算后即得果胶酸钙或果胶酸的重量。 • 咔唑比色法——果胶酸的提取液经除去糖后,用盐酸水解面生成半乳糖醛酸。在强酸介质中,半乳糖醛酸与咔唑起缩合反应,生成紫红色化合物,用比色的方法测定。

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