제 3 장 유전자 조작과 분석기술

1. 제3장 유전자 조작과 분석기술 제한효소 (Restriction enzymes) DNA 연결효소 (DNA ligase) Plasmid vector Transformation (형질전환) Transfection (형질전이) Recombinant DNA technology (재조합 DNA) Clone Cloning PCR 기타

2. Genomic DNA Purification 준비물 Digestion buffer- 10mM Tris-Cl (pH8.0) 25mM EDTA (pH8.0) 100mM NaCl 0.5% SDS 0.1 mg/ml proteinase K Liquid Nitrogen Mortar and Pestle Phenol:chloroform:isoamylalcohol=25:24:1 7.5M Ammonium Acetate 100%/70% ethanol

3. Genomic DNA isolation 1.Grind tissue w/ mortar and pestle in liquid. 2. Suspend the powered tissue in 1.2 ml of digestion buffer. 3. Incubate the samples w/ shaking at 50C for overnight. 4. Extract the samples with an equal volume of Phenol:chloroform:isoamyl alcohol(25:24:1) -vortex 10-20 seconds. 5. Transfer the supernatant to new tube. and add ½ vol. of 7.5M NHAc and 2 vol of 100% EtOH. 6. Transfer the DNA to the new tube using pasture pipette. 7. Rinse the genomic DNA with 70% Ethanol twice. 8. Resuspend DNA in dH2O and incubate at 65C for 1hr. 9. Check concentration of DNA at A260.

6. Minipreps of Plasmid DNA 준비물: LB medium, antibiotic Glucose/Tris/EDTA(GTE) solution NaOH/SDS solution Potassium acetate solution, pH4.8 isopropanol 70% ethanol • Incubate 3-5ml sterile LB medium with a single • bacterial colony and grow to saturation at 37C. • 2. Microcentrifuge 1.5ml of cells 20 seconds. • Resuspend pellet in 200ul GTE solution and • let sit 5 min at room temperature.

7. 3. Add 200ul 0.2N NaOH/1% SDS solution, mix by gently inverting (3-4 times), and place 5 min on ice. 4. Add 200ul potassum acetate solution, mix by gently inverting and place 5 min on ice. 5. Microcentrifuge 3 min and transfer 0.6 ml supernatant to new tube. Add 0.7 ml of isopropanol, and let sit 15 min at –70C. 6. Microcentrifuge 5 min at room temperature, wash pellet with 1ml of 70% ethanol, vortex, spin, discard supernatant and air dry pellet DNA for 5-10 min. 7. Resuspend pellet in 30ul of TE buffer or ddH2O and store at –20C.

8. Plasmid DNA 분리의 원리

10. 마이크로 파이펫 사용법 Micropipette

11. Commonly used electrophoresis buffers Buffer Concentrated stock solution (per liter) Tris-acetate (TAE) 50x242 g Tris base57.1 ml glacial acetic acid100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)Generally used for agarose EP Tris-borate (TBE) 20x121.1 g Tris base61.7 g boric acid7.44 g Na2EDTA-2H2OGenerally used for DNA sequencing

13. UV transilluminator

15. Plasmid DNA on agarose gel

21. Intact Total RNA Distinct 28S ribosomal subunit (or prok. 23S): ideally 2X size of 18S Distinct 18S ribosomal subunit (or prok. 16S) 28S 18S No well defined peaks between ribosomal peaks Marker Flat baseline throughout electropherogram ~100 bp Marker Small peaks are sometimes present after the marker at 24 – 29 seconds. These are represented by 5S and 5.8S subunits, tRNAs, and small RNA fragments about 100bp. These are especially noted when using phenol and trizol extraction methods. They can be removed by treating total RNA through Qiagen columns which removes small RNAs.

22. Restriction Enzyme Mapping of Fragments Digestion with enzyme 1 shows that there are two restriction sites for this enzyme but does not reveal whether the 3kb fragment is in the middle or on the end. Digestion with enzyme 2 shows that the 17kb fragment has a single site. The double digest shows that the 8kb and 6kb fragments from enzyme one are retained and that the 3kb fragment is cut by enzyme 2. Thus the 3kb fragment is in the middle. The double digest fragments indicate that the 6kb fragment plus the 1kb fragment make up the 7kb fragment identified by enzyme 2, while the 8kb + 2kb fragments make up the 10kb fragment identified by enzyme 2. Page 103참조

23. Genotype Determination using RFLP's and a Gene Probe A DNA probe that hybridizes to the 5' end of the human beta globin gene (shown in blue on the diagram below) was used to identify RFLP pieces from members of a family in which sickle-cell hemoglobin (HbS) was segregating. The normal HB allele (HbA) is cut at three places by a particular restriction enzyme (positions shown with red arrows). The HbS mutation destroys the internal restriction site so the HbS gene is cut in only two places. Thus, the probe hybridizes to a 1.15 kb DNA fragment from HbA DNA and hybridizes to a 1.35 kb fragment from HbS DNA.

24. DNA 염기서열 결정

27. U.S. Department of Energy's Joint Genome Institute Genome Sequencing Facility

28. Fluorescent Sequencing

30. DNA Sequence Analysis • All sequencing projects use same basic protocol • Sequence determined approximately 800 bases at a time • Sanger method • Enzymatic extension of DNA to defined terminating base • Approximately 99.9% accurate • Recall sequencing lab

31. General Principals of Sanger Sequencing Method Fig. 9.17

32. Fig. 9.17

33. Fig. 9.17

34. Automated DNA sequencing Fig. 9.18 a

35. Output from an automated DNA sequencing reaction • Each lane displays the sequence obtained from a separate DNA sample and primer Fig. 9.18 b

36. Automated DNA Sequencing Fig. 9.18 c

43. 플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다. 플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다. <분리방법>Minipreps of plasmid DNA bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만 성공률과 속도를 생각하여 세가지 방법으로 소개하면 Alkaline lysis prep, boiling method 그리고 lithium-based procedure 이다. ① Alkaline lysis miniprep alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다 유전자 분리 및 구조분석 DNA 분리의 일반적 사항

44. Plasmid DNA의 분리 Plasmid DNA란 염색체 밖에 존재하는 DNA(extrachromosomal small circular DNA)이다. Plasmid DNA는 그 자체내에 replication origin을 가지고 있어서 박테리아 내에서 염색체 DNA 복제와 상관없이 독자적으로 복제되는 특징이 있다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자 뿐 아니라 항생제 합성이나 독물질 합성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀졌다. Plasmid는 한 세포에서 다른 세포로 옮겨갈 수 있는 성질을 지니고 있으므로 유전자를 옮기는 운반자 혹은 vector로 작용을 한다. 항생제 내성을 지닌다는 이유로 의사들에게는 반갑지 않은 존재로 여겨지지만 분자생물학의 연구에 있어서는 유전자 특성 규명에 없어서는 안될 중요한 수단으로 이용되고 있다. 즉 외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어 주면 이 형질전환된 세포내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA 조각을 cloning하는 vector로 이용될 수 있는 것이다. 분자생물학 실험에 사용되는 plasmid는 자연계에 존재하는 plasmid의 특정 부위를 조합하여 만든 plasmid가 이용된다. 이러한 plasmid는 작고 활성이 높은 relaxed replication origin을 가지고 있으며 적어도 항생제 내성에 대한 한개의 유전자를 지니고 있다. 또한 이들 plasmid 내에는 한가지 제한효소에 의해 단지 한군데만 절단될 수 있는 부위를 여러개 가지고 있으므로 실험실 내에서의 조작을 쉽게 해주고 있다. Plasmid의 소량분리도 최근 여러가지 kit가 상품화되어 있으며 많은 sample을 동시에 빠르고 간편하게 분리할 수 있는 장점은 있지만 경제적이지 못하기 때문에 여기에서는 보통 쓰는 alkali lysis 방법을 기술하기로 하겠다.

45. 실험방법 • 실험재료 Solution 1 : 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA Solution 2 : 0.2 N NaOH, 1% SDS (실험 때마다 새로 만들어서 사용하는 것이 좋다. )Solution 3 : 5 M potassium acetate 60 ml, glacial acetic acid 11.5 ml, 증류수 28.5 ml을 첨가하여 만든다. • 1. LB 배양액 10 ml에 박테리아의 colony를 접종하여 37°C 배양기에서 하룻밤동안 배양한다 • TB(terrific broth)를 쓰면 보다 짧은 시간 내에 더 많은 균을 얻을 수 있다. Colony의 접종은 loop를 이용하는 것이 원칙이나 이쑤시개를 이용하면 더 간편하게 빨리 할 수 있다. • 2. eppen drof 1.5ml tube에 빅테리아가 완전히 자란 배양액을 1.5 ml 담고 6,000 rpm으로 10분간 4°C에서 원심분리하여 박테리아를 침전시킨다. • 3. 상층의 배양액을 완전히 제거하고 남은 균용액을 다시 넣어서 침전시킨다. • 4. 박테리아 침전물에 Solution 1을 200 μl 넣고 vortexing 한다. • * 완전히 부유시키지 못하면 효율이 대단히 줄어든다. tube의 바닥에 남아있는 균이 없도록 철저히 vortexing할 것. • * Solution 1, 2, 3의 양은 균의 양에 따라서 달라질 수 있다. 즉 균이 많으면 300-300-300 μl를 쓰면 된다. 다만 용액들의 비율을 1:1:1로 쓰면 되는데, 때로는 이 비율을 1:2:1.5로 쓰기도 한다. 그러나 앞의 것이 더 깨끗한 DNA를 얻을 수 있는 것 같다. 실험자에 따라서 용액 1에 RNase A를 200 μg/ml 농도로 첨가해서 사용하기도 하지만, 이보다는 과정 10에서 RNase 처리를 해주는 것이 더 좋다.

46. 5. Solution 2를 200 μl 첨가하고 뚜껑을 막은 후 시험관을 천천히 5회 정도 반전 혼합한 뒤 5분간 상온에 둔다. 이때 절대로 vortexing 과 같이 거친 방법으로 혼합해서는 안된다. • * Solution 2를 첨가하면 세포가 용해되므로 sample이 맑아지고 점도가 높아지는 것을 관찰할 수 있다. 이 과정에서 심하게 vortex하면 염색체 DNA가 깨져 나중에 섞여서 분리되게 된다. • 만약 5분이 지나도 용액이 혼탁하면 과정 4에서 vortexing 을 제대로 하지 않았거나 용액의 양이 모자란 경우이다. 용액을 300-300-300 μl 등과 같이 증가시킬 것. • 6. Solution 3을 200 μl 첨가하고 4-5회 반전 혼합한 뒤 얼음 속에 10분간 보관한다. • Solution 3을 첨가한 직후 하얀 침전물이 형성되는데 이들이 눈송이 모양으로 균등하게 이루어져야 한다. 뭉쳐있어도 효율이 감소하고, 너무 심하게 섞어도 좋지 않다. • 7. 4°C 원심분리기에서 13,000 rpm으로 10분간 원침시킨 후 상층액(550~600 μl)을 새 eppen drof로 옮겨 담는다. 가능한 한 하얀 침전물이 섞이지 않도록 한다. • 8. 옮겨 담은 상층액에 0.6~1배부피의 isopropanol과 0.1배 부피의 3M NaOAc을 첨가하여 혼합한 후 -70°C에서 10분 정도 둔다. • 9. 13,000 rpm으로 10분간 4°C에서 원심분리하고 상층액을 완전히 제거한다. • 10. 원하는 양의 TE, pH 8.0 용액 또는 증류수에 녹인다.

48. Gene Cloning