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Approches analytiques de l homocyst ine

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Approches analytiques de l homocyst ine

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Presentation Transcript

    1. Approches analytiques de lhomocystine 1res journes de pharmacie ANNABA 8 -9 Dcembre 2004

    2. Plan Introduction Mtabolisme Milieux Biologiques (prlvements) Mthodes de Dosages : HPLC FPIA Conclusion

    3. Prsentation de la molcule acide amin (AA) soufr apport par les protines de l'alimentation fonction thiol libre: fixation aux protines avec thiol libre (cys ou elle-mme) ? disulfures Forme libre ou lie dans le plasma

    4. METABOLISME

    5. INTERET Lhyperhomocystinmie est implique dans: Maladies auto-immunes Vieillissement cellulaire Maladies neurodgnratives Toxmie et avortements rptition Insuffisance rnale

    6. Milieux biologiques Les Urines Le Sang

    7. Les Urines

    8. Les Urines

    9. ETAT DU SUJET : Jene de 12 h ( influence des protines). La position du sujet. Utilisation du garrot. Arrter certains mdicaments (Mthotrexate , carbamazpine, phnytoine , 6-azaur, NO ) Le sang

    10. Le sang (2)

    11. Mthodes de Dosage HPLC FPIA

    12. HPLC Chromatographie liquide haute performance Mthode de Rfrence Principe : 50l de lchantillon (srum/plasma) + 100 l de ltalon interne +50 l de Rf rducteur(trialkylphosphine) + 100 l de Rf derivation (ABD-F) Incubation 5 mints 50 C ? Prcipitation (TCA) ? Centrifugation Injection du surnageant dans la colonne (ethanol) Detection par fluorescence (? excit =385 nm/ ? emis =515 nm)

    13. HPLC (2) Ractifs Utiliss : Phase mobile ( thanol ) Tampon ( Acide borique ) Ractif de Drivatisation (ABD-F) Agent Rducteur (Trialkyl phosphine) Ractif de prcipitation ( Acide Tri chloro actique) Calibrant 16 mole/l Etalon interne Contrles ( L1 / L2)

    14. HPLC (3) Spcifications du systme HPLC : La pompe : dbit 0,7 ml/min, pression 200 Kg/cm Linjecteur : Volume 20 l (seringue) La colonne ( T constante de 45 1 C) Dtection par fluorescence (? excit =385 nm/ ? emis =515 nm). Un Intgrateur.

    15. HPLC (4) Echantillons : Plasma ou srum (essai en double) peut tre conserv pendant 10 jours (2 8 C), -20C pendant 3 mois, et 4 heures T ambiante.

    16. HPLC (5) Chromatogramme :

    17. HPLC, Avantages VN < 15 mol/l Linarit : 100 mol/l. Limite de detection : sensible, 0.5 mol/l. Excellente Spcificit. Precision de cette mthode : Rptabilit Reproductibilit

    18. HPLC, Avantages Rptabilit : 3 plasma doss 30 fois 1 cycle

    19. HPLC , Inconvnients Cot : mthode coteuse ncessite un matriel appropri. Limites de la technique : Drivatisation par ABD-F est trs spcifique aux composs soufrs ? interfrence des substances (gpts SH) Arrter les Mdicaments : N-actyl cysteine, captopril, pnicillamine.

    20. FPIA Dosage immunologique par polarisation de fluorescence Principe : Hcy-SS-Hcy / Prot-SS-Hcy rduction Dithiothreitol DDT Hcy Hcy + adnosine Hydrolase S-adnosyl-L-Hcy (SAH) La SAH, entre en comptition avec SAH* marque la fluoresceine, pour lier un Ac anti-SAH monoclonal. Detection par fluorescence (? excit=365nm/ ? emiss=448nm)

    21. FPIA Ractifs utiliss : Solution de prtraitement (DTT +Adnosine) SAH hydrolase / tampon phosphate / conservateur. Ac Anti-SAH monoclonal de souris / Tampon phosphate. Le traceur SAH* (fluorescine) / Tampon phosphate. Calibrateurs : 6 flacons de SAH (0, 2.5, 5, 10, 20, 50 mol/l) Contrles : 3 niveaux : L (5.25-8.75) cible 7 mol/l M (10 - 15) cible 12.5 mol/l H (20 - 30) cible 25 mol/l

    22. FPIA Echantillons sanguins : Srum ou plasma ( EDTA tri k+, Hparinate de Li) Centrifugation et sparation immdiate. Le plasma peut tre conserv entre 2 8 C pendant deux semaines, ou congel 20 C stable pendant 8 mois. Eviter les cycles de conglation /dconglation.

    23. FPIA , avantages VN : 5 15 mol/l et 5 20 mol/l (>60ans). Linarit : 50 mol/l Sensibilit : 0.5 mol/l Spcificit : assez bonne, interfrence de la SAM . Prcision : 3 ch / 2 essais par jour pdt 5j analyss en double : Reproductibilit ( sur IMX) :

    24. FPIA , Inconvnients Interfrences :

    25. FPIA Corrlation avec HPLC (mthode rfrence) : coefficient de corrlation = 0.987 ( n = 151, IMX = 0.876 HPLC + 0.312)

    26. FPIA, Etude pratique

    27. MALADIES DU SYSTEME

    28. DIABETIQUES

    29. HYPERTENSION ARTERIELLE

    30. DYSLIPIDEMIES

    31. AVC

    32. THROMBOSES VEINEUSES

    33. MALADIES NEURODEGENERATIVES

    34. AVORTEMENTS A REPETITION

    35. INSUFFISANTS RENAUX

    36. Tableau rcapitulatif: Principales caractristiques des mthodes les plus utilises

    43. Conclusion

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