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Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM. Diagnóstico das Leucemias na Infância. Dra. Maria Lúcia de Martino Lee. EHRLICH - 1877. NEUTRÓFILOS. Desenvolvimento das Técnicas de Coloração. . . BASÓFILOS. . ACIDÓFILOS ( Eo). Descrição morfológica das leucemias.
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Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM Diagnóstico das Leucemias na Infância Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
EHRLICH - 1877 NEUTRÓFILOS Desenvolvimento das Técnicas de Coloração BASÓFILOS ACIDÓFILOS ( Eo) Descrição morfológica das leucemias
AVANÇOS TECNOLÓGICOS Técnicas convencionais: morfologia e citoquímica Imunofenótipo Citogenética convencional Genética molecular. Expressão genética/proteica. SÉCULO XX Reconhecimento da heterogenecidade das leucemias
Reconhecimento subgrupos biologicamente homogeneos Identificação fatores prognósticos Delineamento de tratamentos mais específicos SECULO XXI
Diagnóstico e Classificação • Diagnóstico + classificação precisos= Essenciais para o estudo biológico e o sucesso terapêutico das leucemias infantis; • Sistema de classificação ideal deve ser biologicamente relevante; • Deve ser útil tanto ao onco-hematologista clínico, quanto ao pesquisador; • Deve ser reproduzível e amplamente utilizável.
Sangue Periférico Mielograma Morfológico Citoquímica Imunofenotipagem Citogenética/ Genética Molecular POX/SB FAB Linhagem Sub-linhagem PAS Alterações: - estruturais - numéricas Esterases Diagnóstico das Leucemias
Infiltração MO Tu Aplasia Medular Anemia Meg Leucemias SMD PTI SHF HIV S.ChediakHigashi Calazar Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica
Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica • Aspiração seca: a avaliação será enfocada apenas no SP e no estudo histológico da BIÓPSIA de MO. • Cerca de 20 % dos pacientes com leucemia não apresentam blastos circulantes ao diagnóstico.
Diagnóstico e Classificação das Leucemias AGUDAS • Representam 95 % das leucemias infantis • Proliferação de células imaturas: BLASTOS. • Sua enumeração na MO é fundamental para a definição diagnóstica de leucemia aguda. CRÔNICAS • Representam 3 a 5 % casos das leucemias infantis. • Proliferação de células relativamente bem diferenciadas.
Avaliação Morfológica/Citoquímica • Introduzidas na década de 60, algumas colorações citoquímicas (MPO, SBB, NSE) auxiliam na definição da linhagem e no diagnóstico de alguns subtipos de LMA.
Mieloperoxidase (MPO) • Cora os grânulos primários dos precurssores granulocíticos e menos intensivamente dos monócitos. • Ainda é considerada a reação “gold standard” para a diferenciação morfológica entre blastos linfóides (negativos) e mielóides (positivos).
Negro de Sudan (SBB) • Coloração não enzimática dos fosfolipídeos das membranas dos grânulos. Interpretação de positividade paralela a MPO, porém mais intensa.
Esterases não Específicas (NSE): Esterases não específicas (NSE): • alfa naftil acetato ( ANA ) esterase • alfa naftil butirato (ANB) esterase • Cruciais para a determinação de monoblastos/monócitos. É descrita em escala de 0 a + 4, e somente em níveis +3 ou +4 é caracterizado o blasto como monocítico. • Monócitos maduros reagem menos intensamente que monoblastos.
PAS • Demais (PAS, Esterase Específica - CAE), Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são atualmente de limitado valor diagnóstico.
Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Linfóides: • Representam 80 % das leucemias infantis. • Caracterizam -se pela presença na MO de >25 % de blastos de características linfóides. MIelóides: • Representam 20% das leucemias infantis. • Blastos constituem no mínimo 30% do total das cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais de 20% de acordo OMS.
Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Classificação FAB (1976): • Primeira a unificar a classificação das leucemias • Permitiu a comparação entre diferentes protocolos terapêuticos • Atualmente,ainda é a base citomorfológica para a classificação das LMA e SMD.
(L1, L2, L3) (M1 – M6) 1985 (M7) (RA, RARS, AREB, AREBt, LMMC) Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica FAB LLA LMA SMD
Outras classificações Classificação MIC (1986): • Classificação das LLA e posteriormente das LMA. • Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos e citogenéticos. Classificação da OMS (2001): • Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além de características imunofenotípicas, genéticas e clínicas específicas.
L1 L2 L3 Classificação Morfológica FAB LLA
a/b M4Eo M3v Classificação Morfológica FAB - LMA
2 4 2 10 22 25 25 10 Proporção aproximada de casos LMA na infância por subtipos
Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM Imunofenotipagem das Leucemias Agudas Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
Diagnóstico das LA Definir linhagem/ sublinhagem celular (mieloides,linfoidesB, linfoides T, NK) Definir estágio maturativo do blasto Detecção DRM Futuro Desenvolver e monitorar novas terapias alvo(enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA)Principais finalidades
Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo Vantagens do método • Mede múltiplos parametros em células individuais • Grande número de células analisadas com rapidez • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Imunofenótipo da LLA Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Desenvolvimento da linhagem mielóide Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Classificação Imunológica das LLA Infantis MLL,t(4;11) TEL-AML, Hiperdiploidia t(1;19) t(8;14) Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Classificação Imunológica da LLA T Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Marcadores positivos CD 3c, CD 7 CD5, CD2, tdt CD10 (45 %) CD45 Marcadores positivos/negativos CD19, CD 13, CD33 Marcadores negativos CD79a MPO CD1a, CD3, CD4, CD8 <45 % casos Subdividida 3 estágios maturativos: Dificíl correlação prognóstica Classificação Imunológica da LLA T
CD10 CD19 CD22cy tdt CD79 LLA com co-expressão de antígenos mielóides • Crianças: 4 -35 % • Sem valor prognóstico independente CD33 (25%) CD13 (23%) CD15 (16%) CD14 (16%)
Imunofenotipagem na LMA Essencial: • LMA -MO • LMA - M7 Auxiliar: • LMA -M6 • LMA - M3 • LMA - 2 v • LMA -M4Eo • LMA - M5
Marcadores negativos MPO CD3c CD 79a c CD 22 c --------------------------- CD34,38,HLA-dr, tdt 1/3 dos casos ---------------------- CD 11b,15, as vezes CD2,7,19 fracos Imunofenotipagem das LMAs LMA minimamente diferenciada Marcadores positivos CD 13 CD 33 CD 117
Leucemia Megacarioblástica Aguda Marcadores Positivos • Plaquetários: • CD 41, CD 42,CD 61 Marcadores Negativos ou Positivos: • Mielóides: • CD13 +, CD 33+,CD 117+ Marcadores Negativos: • anti MPO, CD 34, CD 45,HLA - DR