Download
1 / 19
190 likes | 297 Vues
The study investigates the essential role of GPR3 in maintaining meiotic arrest in mouse oocytes. GPR3, a G protein-coupled receptor, is predominantly expressed in oocytes and regulates cAMP levels crucial for sustaining prophase I arrest. The research demonstrates that reducing GPR3 expression through siRNA leads to the resumption of meiosis in oocytes, requiring precise conditions for effective RNA intervention. This highlights the potential of modulating GPR3 expression in understanding meiotic regulation and advancing reproductive biology.
E N D
„Oocyte-specific expression of Gpr3 is required for maintenance of meiotic arrest in mouse oocytes.” Lisa M.Mehlmann „Ekspresja Gpr3 w oocycie jest wymagana do utrzymania bloku mejotycznego w oocytach myszy” Monika Ostrowska
Oocyty • oocyt+komórki pęcherzykowe= pęcherzyk jajnikowy • Oocyty zatrzymane są w profazie I • utrzymanie profazy zależy od wysokiego poziomu cAMP • oocyty,które zakończyły okres wzrostu i zasiedlają duże pęcherzyki z formującą się jamką nabywają zdolność do zapłodnienia • wznawiają mejozę w odpowiedzi na wyrzut hormonu LH.. • LUB zrobią to samorzutnie jeśli usunie się je z pęcherzyka jajnikowego
Jak powstaje cAMP? ? • Receptor GPR3 stymuluje białko Gs • aktywne białko Gs stymuluje cyklazę adenylową • aktywność cyklazy adenylowej powoduje wzrost cAMP • cAMP aktywuje kinazę A • ...ciąg przekazywania informacji.. • hamowanie kompleksu cyklinaB -CDK1 • oocyt utrzymany w profazie I
Co wiemy o GPR3.. • Jest receptorem połączonym z białkiem Gs • ekspresja Gpr3 mRNA zachodzi zwłaszcza w oocycie, ALE także,choć na niższym poziomie, w otaczających go komórkach pęcherzykowych (GPR3 jest zlokalizowane w oocycie, ale także prezentowane wszędzie w pęcherzyku) • Odpowiedzialny za produkcje cAMP w oocycie (co najmniej w dużej części)
GPR3 w oocycie czy w otaczających go komórkach pęcherzykowych jest niezbędny do utrzymania bloku mejotycznego w oocycie?
Interferencja RNA • Do oocytów w pęcherzykach jajnikowych wstrzyknięto małe dwuniciowe interferujące RNA- siRNA • RNA było skierowane przeciwko Gpr3 • zapoczątkowało to sekwencjo-specyficzną degradację mRNA • cel: redukcja mRNA kodującego Gpr3 w oocytach
Doświadczenie IMikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów otoczonych pęcherzykiem • Grupy: - 50nM Gpr3 siRNA - 5nM Gpr3 siRNA - 100nM mutGpr3 siRNA - 100nM GAPDH siRNA - kontrola- bez mikroiniekcji • oocyty w pęcherzykach bez jamki (140-180mikrom średnicy) • czas hodowli 3dni • izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie
Wyniki • GVBD : • kontrola - 2% • 5nM Gpr3 siRNA - 15% • 50nM Gpr3 siRNA - 67% • mutGpr3 siRNA - 5% • GAPDH siRNA - 0% • 64% oocytów GVBD z Gpr3 siRNA wyrzuciło ciałko kierunkowe
Wnioski • redukcja Gpr3 RNA w obrębie mysiego oocytu powoduje wznowienie mejozy • wznowienie podziału mejotycznego w oocytach z Gpr3 siRNA było dozo-zależne
Doświadczenie IIRT-PCR • Grupy oocytów: - z Gpr3 siRNA - kontrolna - mutGpr3 siRNA • przygotowane jednakowe ilości cDNA • startery nakierowane przeciwko : Gpr3 i rybosomalnego białka L19 – Rpl19
Wyniki • Wstrzykniecie Gpr3 siRNA zmniejszyło ilość Gpr3 mRNA do 10 % w stosunku do obecnego w oocytach kontrolnych. • Ilość Rpl 19 mRNA-niezmieniona. • mutGpr3 siRNA nie zmniejszyło ilości Gpr3 mRNA
Wnioski • RNAi nakierowane na Gpr3 jest specyficzne. • Mikroiniekcja Gpr3 siRNA powoduje skuteczną redukcje Gpr 3 RNA w oocytach w pęcherzykach jajnikowych u myszy.
Doświadczenie IIIMikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów izolowanych/ RT-PCR • Grupy oocytów: - 50nM Gpr3 siRNA - kontrola • hodowano w obecności 4nM hypoksantyny, przez 26-45h • izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie • RT-PCR jak poprzednio
Wyniki • 16% izolowanych oocytów wznowiło mejozę < jest to znacznie mniej w porównaniu z 67% w pęcherzykach> • redukcja Gpr3 mRNA mniejsza niż u oocytów w pęcherzykach
Wnioski • RNAi powoduje wznowienie mejozy i redukcję Gpr3 mRNA w izolowanych oocytach ale w mniejszym stopniu niż w zamkniętych w pęcherzykach oocytach • RNAi jest bardziej efektywna w oocytach otoczonych pęcherzykiem • ograniczony czas hodowli oocytów wyizolowanych- nie wystarczający do obniżenia ilości białka Gpr3 wcześniej-istniejącego i efektywnego zredukowania mRNA
Powiązanie z poprzednimi doświadczeniami • 70% GVBD obserwowanych po iniekcji siRNA do oocytu to bardzo blisko do 80-90% zaobserwowanych przy usunięciu Gpr3 RNA z zarówno oocytu jak i komórek pęcherzykowych u myszy z knockout-em Gpr3 • zdolność do utrzymania profazy I w oocycie u myszy z knockout-em Gpr3 może być uratowana jeśli przeprowadzimy mikroiniekcję RNA kodującego Gpr3 do oocytu otoczonego pęcherzykiem
Podsumowanie • Redukcja GPR3 specyficznie w oocycie otoczonym pęcherzykiem powoduje wznowienie mejozy • utrzymanie bliku mejotycznego jest zależne od obecności GPR3 w oocycie • metoda redukcji RNA w pęcherzykach jajnikowych, które mogą być hodowane przez czas wystarczający do redukcji endogenicznych białek, powinna znaleźć zastosowanie w stosunku do wielu innych białek, które mogą być zaangażowane w zatrzymanie mejozy, wznowienie mejozy, zapłodnienie czy wczesny rozwój zarodkowy
Podsumowanie cz.2 • Jest możliwe, że komórki pęcherzykowe mogą produkować cAMP i dostarczać go przez „gap junctions” do oocytu ...ALE ilość produkowanego przez nie cAMP jest niewystarczająca do utrzymania stanu zatrzymania mejozy-za to odpowiada cAMP produkowane przez oocyt • mimo to oocyt oddzielony od pęcherzyka spontanicznie wznawia mejozę...dlaczego? Hipoteza: komórki pęchrzykowe wysyłają sygnały pobudzające Gpr3 do aktywności. (hipoteza niepotwierdzona)
