ХРОМАТОГРАФСКИ МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ

1. ХРОМАТОГРАФСКИ МЕТОДИ ЗА АНАЛИЗ • Хроматографията е общо название на методи, при които две или повече съединения в една смес се разделят физически чрез разпределението им между две фази: а) стационарна фаза, която може да бъде твърда или течна, нанесена върху твърда, и б) подвижна фаза, газ или течност, която непрекъснато тече около стационарната фаза. Разделянето на индивидуални компоненти се осъществява главно вследствие на разликите в афинитета им към стационарната фаза. • Хроматографията е открита и наименована през 1906 г. от руския ботаник Михаил Цвет, който се опитал да раздели оцветени пигменти от листа, пропускайки разтвора, който ги съдържал през колона с варовик. През 1941 г. Мартин и Синдж откриват течно-течната хроматография, а през 1952 г. получават Нобеловата награда по химия за значимостта на откритието.

2. КЛАСИФИКАЦИЯ НА ХРОМАТОГРАФСКИТЕ СИСТЕМИ • Спрямо агрегатното състояние на подвижната фаза: газова и течна хроматография; • Спрямо видът на неподвижната фаза: газово-твърда; газово-течна; течно-твърда и течно-течна; • Според типа на разпределителното равновесие: адсорбционна (твърд сорбент); абсорбционна (течен сорбент); • В зависимост от геометрията на хроматографската система: колонна и планарна.

3. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Задържане: Мярка за степента на задържане е величината “капацитетен фактор” к’x, която се дефинира със следния израз: Vs . Xs Vs к’x= ------------------ = ----------- . Kx, Vm . Xm Vm където Vs и Vm са съответно обемите на стационарната фаза и на подвижната фаза в колоната, Xs и Xm са респ. моловете от аналита в стационарната и подвижна фаза и Кх се явява термодинамичен разпределителен коефициент. Въз основа на капацитетния фактор се извежда основното уравнение за всеки хроматографски процес, което свързва обемът на задържане с други величини: Vr = Vm (1 + к’x) = Vm + Vs . Kx

4. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Vm се означава като празен обем (“мъртъв обем”) и той е равен на F. to, където F e скоростта на потока (ml/min), а to е времето, необходимо на една въведена молекула от разтворителя или всяко друго незадържащо се съединение да премине през колоната. При заместване в основното уравнение се получава: tr - to к’x= ---------- to • В ТСХ или хартиена хроматография степента на задържане за едно съединение е неговата Rf стойност, дефинирана като отношение на разстоянието, изминато от веществото, към разстоянието, изминато от фронта на разтворителя.

5. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Ефективност на колоната: Количествена мярка за ефективността на колоната е броят на теоретичните тарелки N: N = 16 . (tr/tw)2 , където tw е ширина на пика. Моделът на теоретичната тарелка предполага, че колоната е изградена от серия тарелки. При всяка се осъществява равновесно разпределение на веществото между подвижната и стационарната фаза. По този начин, колкото е по-голяма стойността на N, толкова е по-голяма възможността за разделяне.

6. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Друг параметър за ефективността на колоната е височина, еквивалентна на една теоретична тарелка (ВЕТТ): H = L/N, където L е дължината на колоната. Колона или тарелка с ниска Н стойност е по-добра от друга с висока стойност. Стойностти на Н под 1 до 3 mm са обичайни за ГХ, а в съвременната HPLC те са с 1 до 2 порядъка по-ниски. • Фактори, които допринасят за разширяването на ивицата: - масопренасянето на веществото в стационарната фаза или в подвижна фаза, съдържаща се в порите на пълнежа; - масопренасянето на веществото в подвижната фаза; - турбулентна дифузия;

7. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Всички фактори, които допринасят за разширяване на ивицата се описват със следния израз: 1 H = ------------------------ + Hld + Hsm + Hsp, (1/Hed + 1/Hmp) където Hed изразява турбулентна дифузия; Hmp – масопренасяне в подвижната фаза; Hld – надлъжна дифузия; Hsm – масопренасяне в застояла подвижна фаза в колоната; Hsp – масопренасяне в стационарната фаза. От уравнението се определят експерименталните условия, които минимизират стойността на Н – тя намалява с намаляване на размера на частиците, линейните скорости, дебелината на филмите от стационарната фаза, вискозитета на подвижните фази, повишаване на температурата и равномерното запълване на колоната с частиците на пълнежа.

8. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ • Степен на разделяне (разрешение) - R: trB - trA R = 2 . ------------- twA + twB Разрешението се определя чрез разстоянието между максимумите на пиковете и ширината на пика или ивиците. Разделянето на пиковете е свързано с фактора на селективност a, понякога наричан и относително задържане: trB – to k’B a = -------------- = ------- trA – to k’A

9. ХРОМАТОГРАФСКИ ПАРАМЕТРИ Селективността е термодинамична величина, зависеща от относителното разпределяне на веществото между подвижната и стационарната фаза. Отнася се до способността на една хроматографска система да разграничи два компонента. При стойности на a, клонящи към 1, много трудно се извършва разделяне. Селективността може да се прогнозира като се познават възможните молекулни взаимодействия между веществото и стационарната фаза, като например образуването на водородни връзки или киселинно-основни взаимодействия. За изменение на селективността се променят стационарната фаза, подвижната фаза или и двете.

10. ТСХ ТСХ представлява планарна хроматография, която се осъществява върху открита плоча – плака от стъкло, алуминий или пластмаса с определени размери. Плаката е покрита с порьозен твърд прах, съставен от малки частици с диаметър от 5 до 40 mm. Обикновено използваните фази включват силикагел, алуминиев оксид, целулоза, полиамидни и йонообменни смоли, както и свързващо вещество. За аналитични цели се използва слой с дебелина 0.2 до 0.3 mm, а за препаративни – от 2 до 10 mm. Развитите плаки се визуализират чрез напръскване с цветообразуващи реактиви или наблюдение под УВ-облъчване.При предварително добавяне към слоя на флуоресциращ агент, разделените вещества, благодарение на своя ефект на гасене, се проявяват като тъмни петна върху флуоресциращ фон при 254 и 366 nm. Експериментални фактори, които влияят върху възпроизвеждането на Rf са природата на адсорбента, природата на подвижната фаза, активността на адсорбента, неговата дебелина и еднородност, температурата, концентрацията на веществата в пробата, равновесието в парното налягане между плаката и атмосферата на проявителната камера. Количествени аспекти на ТСХ: 1. Визуално сравняване на петната спрямо такива на референтни разтвори. 2. Физични измервания на петната: измерване на пропускливост, отражение или флуоресценция със спектрофотометър; измерване на интензитета на петното чрез сканиращ денситометър. 3. Радиоактивни измервания. 4. Измервания на повърхността на петното.

11. ТСХ Денситометрия – метод за количествено тънкослойно хроматографско определяне, базиращо се на облъчване на петното от ТСХ-плаката с вълна с определен интензитет и съгласно Закона на Бугер-Ламбер-Беер се измерва намалението в интензитета на светлината, което е правопропорционално на концентрацията вещество, или се измерва: интензитет на отразената светлина (ремисия); интензитет на флуоресценция

12. ТСХ ХАРАКТЕРИСТИКИНА СКАНИРАЩ ДЕНСИТОМЕТЪР: - Не изисква допълнително PC; - Анализ и публикуване на качествени образи; - Високо чувствителна CCD камера, 12bit образ; - Compact Flash управление на фона; - IP- адрес; - Възможност за принтиране; - Оптично увеличение; - Възможност за оптимално разпределение на пикселите; - Възможност за анализ през деня.

13. ТСХ

14. ВЕТХ ВЕТХ е разделителен метод с висока чувствителност и селективност и според използвания детектор с голям линеен диапазон и добра възпроизводимост. Прилага се едновременно за идентичност и количествено определяне на основната съставка, “related substances” и примесите. За идентичност на целевата компонента валидирането на ВЕТХ изисква да се докаже необходимата селективност, а при количествено определяне и за определяне на LOD и LOQ е необходим външен сертифициран стандартен материал. Възможно е да се използва и метода на вътрешния стандарт като избраното за вътрешен стандарт вещество трябва да дава самостоятелен пик при добавяне в известна концентрация. Също така при добавяне в равни концентрации вътрешният стандарт трябва да има относителен фактор на отклика, отчитащ разликите в площите (RRF – relative response factor), чиято стойност е в интервала: 0.8 < RRF < 1.2.

15. ВЕТХ КОЛОНИ ЗА ВЕТХ: - По своя диаметър те биват нормални (4-8 mm), тесни (2-4 mm), микро- (1-2 mm) и запълнени капиляри (< 1mm). - в масовия случай основен органичен лиганд остава силикагел. Основен недостатък е наличието на повърхността му на активни силанолни групи. С 18, С 8, С 4 и <С2 се получават чрез обработка с хлорсилани. Обработката с триметилхлорсилан води до намаляване на влиянието на силанолните групи (end capping). Същото може да се постигне и при покритие с полимер или създаване на силоксанови мостове. - други носители съдържат циано-, амино-, фенил-, диол- и др. функционални групи, както и полимерни, гелни, катионни, анионни, водноразтворими, воднонеразтворими, йонообменни покрития. - колоните се тестват с универсални процедури за оценка на възпроизводимостта.

16. ВЕТХ СПЕЦИАЛНИ КОЛОНИ: - хирални колони – предназначени са за разделяне на енантиомери и за доказване на хирална чистота. Определянето се основава на няколко подхода: а) геометричен – като н.ф. се използват циклодекстрини, модифицирани за придобиване на липофилни свойства; б) подход на база p – p взаимодействия. С носителя се свързва хирален селектор. - колони с ограничен достъп – предназначени са при анализ на биологични течности и представляват хидрофобно ядро, обгърнато с хидрофилна “мрежа”. При този анализ молекулите на лекарствените вещества и техните метаболити преминават през “мрежата” за разлика от големите протеинови молекули. - рН устойчиви колони

17. ВЕТХ ДЕТЕКТОРИ: - UV-VIS детектор – универсален с чувствителност ng/ml. Основен недостатък е необходимостта от използване на UV-неактивни разтворители. - рефрактометричен детектор – универсален с ниска чувствителност. Основен недостатък е необходимостта от прецизен температурен контрол. - електрохимичен детектор – селективен с чувствителност pg/ml. Основен недостатък е възможна адсорбция на солюта и необходимостта от използването на ел.химично неактивни разтворители. - флуоресцентен детектор - селективен с чувствителност pg/ml. Основен недостатък е ограниченият обхват на приложение. - масспектрален детектор - селективен с чувствителност ng/ml. Основен недостатък – изисква летливост, работи при висока температура и не използва неорганични буфери.

18. Хроматографски методики Изпитване за идентичност: • Гарантира присъствието на обявеното вещество в пробата. Изпитваният материал се сравнява със сертифициран сравнителен материал. Изпитването трябва да е съобразено със структурата на веществото и наличието на примеси. Обикновено подтвърждаването на идентичността на анализирания обект с обявения изисква и други тестове (напр. при изпитването за идентичност на моноенантиомер е необходимо да се определи и ъгъл на въртене на поляризованата светлина или да се направи масспектър; при анализ на полимер – освен гелна хроматография се изисква и ИЧ спектър). • За да има хроматографсктото разделяне сигурни идентифициращи възможности, се съчетава със спектрален детектор – селективността се представя със съответната хроматограма.

19. Хроматографски методики Изпитване за количествено определяне: • Количественото определяне е част от системата на контрол на качествотото. В повечето случаи се използва “калибриране” – серия от действия, които установяват, при определени условия, съотношението между стойностите, показани от системата за измерване (СИ) и приетата стойност на даден сравнителен еталон (СЕ). СЕ са няколко типа: вътрешен – изработен от потребителя за собствени нужди; външен – предоставен на потребителя и сертифициран (еталон). Като краен резултат от калибрирането се приема представянето на функционална зависимост, която се използва за изчисляване на резултатите от измерването. • При наличие на “линейност” се използва алтернативна “едноточкова” методика за оценка на калибриращата функция.

20. Хроматографски методики Изпитване за количествено определяне на примеси: • При количествено определяне на примеси се процедира в зависимост от това дали примесите се лимитират (от количествена гледна точка) или дали са допустими като вещества (от гледна точка на токсичност). Обикновено количественото съдържание е недостатъчна оценка. За достоверност се използват различни подходи: сравнение на резултатите с тези от изкуствена смес (към placebo се добавят лекарственото вещество и съответните примеси в определено количество); сравнят се резултати, получени и с независима аналитична процедура (полярографски) и т.н. Ако методът не е селективен, той задължително се придружава с друг селективен хроматографски метод за изпитване за чистота по отношение на пречещите компоненти. При наличие на различни от очакваните примеси (разпадни продукти, странични непредположени реакционни продукти) най-ефективни са комбинации със спектрални детектори, а също наличието на предварителни изследвания за кинетика на реакционните процеси и химическа стабилност.

21. Примеси на Ibuprofen A.2-(3-isobutylphenyl)propionic acid, D.2-(4-methylphenyl)propionic acid, B.2-(4-butylphenyl)propionic acid, (RS)-2-(4- isobutylphenyl)propionic acid, E.4´-isobutylacetophenone. C.2-(4-isobutylphenyl)propionamide,

22. Related substances Examine by liquid chromatography (2.2.29). Test solution. Dissolve 20 mg of the substance to be examined in 2 ml of acetonitrile R and dilute to 10.0 ml with the mobile phase. Reference solution (a). Dilute 1.0 ml of the test solution to 100.0 ml with the mobile phase. Reference solution (b). Dissolve 20 mg of ibuprofen CRS in 2 ml of acetonitrile R, add 1 ml of a 0.06 g/l solution of 2-(4-butylphenyl)propionic acid CRS in acetonitrile R and dilute to 10.0 ml with the mobile phase. The chromatographic procedure may be carried out using: —a stainless steel column 0.15 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 µm), —as mobile phase at a flow rate of 2 ml per minute a mixture of 0.5 volumes of phosphoric acid R, 340 volumes of acetonitrile R and 600 volumes of water R; allow to equilibrate and dilute to 1000 volumes with water R, —as detector a spectrophotometer set at 214 nm. Equilibrate the column with the mobile phase at a flow rate of 2 ml per minute for about 45 min. Adjust the sensitivity of the system so that the height of the principal peak in the chromatogram obtained with 20 µl of reference solution (a) is 70 per cent to 90 per cent of the full scale of the recorder. When the chromatogram is recorded in the prescribed conditions, the retention time of ibuprofen is about 20 min. Inject 20 µl of reference solution (b). Measure the height (A) above the base-line of the peak due to 2-(4-butylphenyl)propionic acid and the height (B) above the base-line of the lowest point of the curve separating this peak from the peak due to ibuprofen. The test is not valid unless A is greater than 1.5 times B. If necessary, adjust the concentration of acetonitrile in the mobile phase in order to obtain the required resolution. Inject separately 20 µl of the test solution and 20 µl of reference solution (a). Continue the chromatography for 1.5 times the retention time of the principal peak. In the chromatogram obtained with the test solution, the area of any peak corresponding to 2-(4- butylphenyl)propionic acid is not greater than that of the peak due to 2-(4-butylphenyl)propionic acid in the chromatogram obtained with reference solution (b) (0.3 per cent); the area of any peak, apart from the principal peak and any peak corresponding to 2-(4- butylphenyl)propionic acid, is not greater than 0.3 times the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a) (0.3 per cent) and the sum of the areas of any such peaks is not greater than 0.7 times the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a) (0.7 per cent). Disregard any peak due to the solvent and any peak with an area less than 0.1 times the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a).

23. Определяне на Ibuprofenв Ibuprofen гел Assay Carry out the method for liquid chromatography, Appendix III D, using the following solutions. For solution (1) disperse a quantity of the gel containing 50 mg of Ibuprofen with 50 ml of warm methanol for 10 minutes, cool and add sufficient methanol to produce 100 ml. Dilute 10 volumes of this solution to 20 volumes with the mobile phase. For solution (2) dilute 10 volumes of a solution containing 0.05% w/v of ibuprofen BPCRS in methanol to 20 volumes with the mobile phase. The chromatographic procedure may be carried out using (a) a stainless steel column (25 cm × 4.6 mm) packed with stationary phase C (10 µm) (Nucleosil C18 is suitable), (b) a mixture of 3 volumes of orthophosphoric acid, 247 volumes of water and 750 volumes of methanol as the mobile phase with a flow rate of 1.5 ml per minute and (c) a detection wavelength of 264 nm. Calculate the content of C13H18O2 using the declared content of C13H18O2 in ibuprofen BPCRS.

24. Clenbuterol hydrochloride contains not less than 99.0 per cent and not more than the equivalent of 101.0 per cent of (RS)-1-(4-amino- 3,5-dichlorophenyl)-2-[(1,1-dimethylethyl)amino]ethanol hydrochloride, calculated with reference to the anhydrous substance.

25. ПРИМЕСИ НА CLENBUTEROL A. R1 = H, R2 = Cl: 4-amino-3,5-dichlorobenzaldehyde, B. R1 = CH2-NH-C(CH3)3, R 2 = Cl: 1-(4-amino-3,5- dichlorophenyl)-2-[(1,1-dimethylethyl)amino]ethanone (clenbuterol- ketone), C. R1 = CH3, R2 = Cl: 1-(4-amino-3,5-dichlorophenyl)ethanone, D. R1 = CH3, R2 = H: 1-(4-aminophenyl)ethanone, E. R1 = CH2Br, R2= Cl: 1-(4-amino-3,5-dichlorophenyl)-2- bromoethanone. Ph Eur

26. Related substances Examine by liquid chromatography (2.2.29). Test solution. Disperse 100.0 mg of the substance to be examined in the mobile phase and dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Reference solution (a). Dilute 0.1 ml of the test solution to 100.0 ml with water R. Reference solution (b). Dissolve 10 mg of clenbuterol impurity B CRS in 20 ml of the mobile phase, add 5 ml of the test solution and dilute to 50.0 ml with the mobile phase. The chromatographic procedure may be carried out using: — a stainless steel column 0.125 m long and 4 mm in internal diameter, packed with end-capped octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 µm), — as mobile phase at a flow rate of 0.5 ml/min a mixture of 200 volumes of acetonitrile R, 200 volumes of methanol R and 600 volumes of a solution prepared as follows: dissolve 3.0 g of sodium decanesulphonate R and 5.0 g of potassium dihydrogen phosphate R in 900 ml of water R, adjust to pH 3.0 with dilute phosphoric acid R and dilute to 1000 ml with water R, — as detector a spectrophotometer set at 215 nm, maintaining the temperature of the column at 40°C. Inject 5 µl of reference solution (a) and 5 µl of reference solution ( b). Adjust the sensitivity of the system so that the height of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a) is at least 50 per cent of the full scale of the recorder. When the chromatogram are recorded in the prescribed conditions, the retention time of clenbuterol is about 11 min. The test is not valid until in the chromatogram obtained with reference solution (b) the resolution between the peaks corresponding to impurity B and clenbuterol is at least 2.5. Inject 5 µl of the test solution and continue the chromatography for 1.5 times the retention time of the principal peak. In the chromatogram obtained with the test solution: the area of any peak apart from the principal peak is not greater than the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a) (0.1 per cent) and the sum of the areas of all the peaks apart from the principal peak is not greater than 2 times the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a) (0.2 per cent). Disregard any peak with an area less than 0.1 times the area of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution (a).

27. HPLC определяне на Diazepam

28. HPLC определяне на Diazepam и Bromazepam в кръвна плазма

29. Хроматограма на таблетки Amoxicillin500 mg