Aboud, Mariana Merwaiss, Fernando Renner, María

1. Aboud, Mariana Merwaiss, Fernando Renner, María

2. Necesidad de un mecanismo para limitar acumulación de mutaciones inducidas por replicación. Stem cells • Responsables de mantenimiento y reparación de tejidos • Se dividen para suplir faltas Autorrenovación de stem • cells durante la división Alta frecuencia de replicación Checkpoints Pero baja capacidad de reparación de DNA Cáncer Mutaciones

3. Hipótesis: Mecanismo distingue cromátidas por edad. Separa cadenas abuelas (a una célula hija) de las cadenas madre (a la otra célula). División celular asimétrica Cosegregación de cromátidas por edad Hipótesis de la cadena inmortal John Cairns (1975) 1 hebra templada (abuela) 1 hebra nueva (madre) • Cromosoma recién sintetizado Errores por replicación

4. Hebra inmortal retenida en stem cell • Célula con templado • abuelo (azul) • stem cell (autorrenovación) • Célula con templado más • nuevo (rojo o gris) • a diferenciación

5. Segregación random y no random Extremo: stem cells retienen cadenas originales toda la vida. Código genético original preservado

6. Ventajas de la hipótesis • La célula hija, con destino diferenciado, contendrá las mutaciones de la replicación. • El pool de stem cells retendrá el templado original durante la vida del organismo. • Las stem cells con cadenas inmortales no están sujetas al acortamiento telomérico durante la replicación. Asumen que el intercambio entre cromátidas hermanas y la recombinación mitótica son extremadamente bajas. Suponen que las cadenas de DNA son diferenciables en su rol como templado en la replicación.

7. Evidencias Apoyo de la Teoría Inmortal

8. Repetición en plantas y hongos (Lark et al., 1967) • Cosegregación de las marcadas • En mamíferos: trabajaron con stem cells del epitelio intestinal. • Intentaron marcarlas durante su formación (Potten et al.,1978, • Largos períodos de retención 2002) Evidencias • Fibroblastos de embriones con 3H-Timidina (Lark et al., 1966) Cuantificación de la distribución de marcación en sucesivas generaciones Segregación no random de cadenas marcadas

9. Se ven ambas marcaciones en la mayoría de las células proliferación • Días después las células con 3H-Td pierden BrdU Experimentos convincentes(Potten et al., 2002) Cadenas marcadas con 3H-Td Se agrega BrdU para marcar las recientemente sintetizadas

10. Stem Cells del músculo esquelético • Uso de marcadores diferenciales en las múltiples divisiones permite ver: (Conboy et al., 2007) • Las células hijas obtienen diferentes destinos. • Las cadenas más viejas quedan en la célula de fenotipo menos diferenciado. • Progenitores marcados in vivo presentaron una frecuencia de división asimétrica del 50% aproximadamente

11. Para estudios futuros • La falta de un marcador in situ no permite obtener resultados inequívocos. • Experimentos realizados in vitro deberían poder repetirse in vivo. • Descubrimiento de los mecanismos moleculares.

12. En este ensayo se resumen varias objeciones a la hipótesis de la hebra inmortal y se discuten algunas limitaciones sobre los enfoques experimentales que ponen a prueba la misma.

13. Solo ha sido probada en tejidos de mamíferos, en los cuales la identidad de las stem cells todavía es incierta. • No es claro qué fracción de las divisiones celulares llevan a cabo dicha división asimétrica. • Pueden generarse mutaciones si se producen fallas en la reparación del ADN. • Los genes en la nueva hebra sintetizada deberían mostrar muchas más mutaciones que los que se encuentran en el templado.

14. Los mecanismos de reparación SCE interferirían con el mantenimiento de la hebra inmortal. • La disminución de los telómeros ocurre en las stem cellsque retengan o no a las hebras templado. • La secuencia de bases no es el único determinante entre el normal desarrollo o la formación de un tumor. • No hay reportes que indiquen que las células de la línea germinal o las células embrionarias muestren segregación asimétrica.

15. Todas las experiencias existentes describen aproximaciones indirectas que sufren de varias limitaciones: • Algunas células que retienen la marca pueden haber sido células • que se diferenciaron después de la mitosis en lugar de stem cells • divididas asimétricamente. • Evidencia de la segregación asimétrica del ADN marcado en cultivos • puede haber venido de células que no están relacionadas y que se juntaron cuando se las fijó en el cultivo. • La mayoría de la información publicada son ilustraciones mostrando imágenes cualitativas mas que información cuantitativa.

16. ¿Podría haber otra explicación? La hipótesis de la “hermana silenciosa” Una explicación alternativa a la hipótesis de la hebra inmortal es que la división celular asimétrica y el destino de las células son codirigidas por diferencias epigenéticas entre cromátidas hermanas (tanto en los centrómeros como en ciertos sitios del genoma). Hace referencia a todos aquellos factores no genéticos que intervienen en la determinación del desarrollo de un organismo

17. Las dos cromátidas hermanas en cromosomas metafásicos llevan distintas marcas epigenéticas (indicadas con + y -) en los centrómeros y en ciertos genes que determinan a las stem cells (A, expresado; a, silenciado). Las diferencias epigenéticas entre los centrómeros permiten la segregación específica durante la mitosis. Esta segregación asimétrica de las cromátidas regula la expresión de ciertos genes presentes en las mismas en las células hijas.

18. Segregación asimétrica Una célula hija se diferencia (D) (Tiene las copias silenciadas de los genes de autorrenovación) La otra continua siendo una stem cell (S) (Tiene las copias activas de los genes de autorrenovación)

19. Segregación al azar Las dos células hijas continúan siendo stem cells Ambas células hijas heredan una mezcla al azar de genes activos e inactivos, lo cual generalmente restaura la expresión de los genes de las stem cells en ambas si las células reciben las señales apropiadas desde el microambiente (el nicho de stem cells).

20. Objetivo Encontrar evidencia directa de la segregación de viejos y nuevos templados en la regeneración de progenitores miogénicos.

21. Metodología: Herida en músculos Músculos de las extremidades Inyecciones de Cardiotoxina I en 24 sitios Herida necrótica difusa Activación de stem cells Regeneración

22. Marcado con CldU e IdU Herida en músculo 48 hs Pulso de CldU 12 hs Pulso de IdU Modelos de segregación al azar y no al azar de cadenas templadas. Marcadas con CldU en un ciclo y con IdU en el siguiente.

23. Naturaleza de células y estado del ciclo celular Marcado con CldU e IdU Disección del músculo Disociación de fibras por trituración o digestión Plaqueo de a 1 célula Fin de mitosis Bloqueadas en citocinesis Fijado y lavado Permeabilizado Incubado con Chicken IgY anti-Syn-4 Incubado con Mouse anti-Pax7 Incubado con Rat anti-Ki67 Ab secundario Ab secundario Ab secundario

24. Naturaleza de células y estado del ciclo celular • Modo de detección Microscopía inmunofluorescente Células miogénicas Células en proceso de replicación Cuantificación de pares positivos para los marcadores (80%) Syn-4, Pax7: marcadores de células miogénicas. Ki67: marcador de proliferación celular.

25. Análisis de distribución de marcas de CldU e IdU Marcado con CldU e IdU Disección del músculo Disociación de fibras por trituración Ambas marcadas con IdU Plaqueo a baja densidad Fin de mitosis Bloqueadas en citocinesis Hubo replicación en el 2º ciclo Fijado Sólo una marcada con CldU Permeabilizado En el 2º ciclo, todas las cromátidas hijas sintetizadas en el 1º ciclo (cadenas madre) van a una sola célula hija. Incubado con Ab anti-CldU y anti-IdU

26. Cuantificación de pares asimétricos • En la experiencia anterior (in vivo) hay segregación asimétrica en el 50% de los casos. • En sistema ex vivo hay segregación asimétrica en el 30% de los casos. • En un sistema in vitro (mioblastos proliferando) hay segregación asimétrica sólo en el 5% de los casos. 50% Es importante el contexto para la segregación asimétrica (stem cell niche). 30% 5%

27. Protocolo alternativo: marcado con BrdU Herida en músculo 48 hs Pulso de BrdU Par simétrico Disección del músculo Disociación de fibras por trituración Par asimétrico Plaqueo a baja densidad Fin de mitosis Bloqueadas en citocinesis Fijado Se observa el mismo porcentaje de segregación asimétrica que en el protocolo anterior (en la mitad de las células). Permeabilizado Incubado con Abs

28. Experimento enfocado en la proliferación de las stem cells miogénicas y de su progenie • Examinaron pares de células con expresión diferencial de Desmina. Desmina: Su expresión es considerada marcador de diferenciación. • Analizaron pares marcados asimétricamente con BrdU y expresión de Desmina.

29. Método de marcado: Co-Inmunotinción Herida en músculo Pulso de BrdU Disección del músculo Plaqueo de a 1 célula Fin de mitosis Bloqueadas en citocinesis Fijado Permeabilización Incubado con Ab primario Rat anti-BrdU Rabbit anti-Desmin Detección por microscopía de inmunofluorescencia Incubado con Ab secundario

30. Relación entre templado “joven’’ (BrdU+) y destino diferenciado (Des+) Destino celular asociado a la segregación 79%

31. Cuantificación de expresión de Desmina en progenie con segregación simétrica de BrdU (50% del total) División simétrica a progenitores División simétrica a mioblastos 59% 31% 9%

32. Sca-1 • Marcador de progenitores indiferenciados • Derivado de músculo esquelético Desmina Debido a la estrecha relación existente entre la asimetría de Desmina y la de BrdU, la Desmina será utilizada como marcador de la segregación asimétrica de los templados marcados.

33. Cadena más “vieja” (Des-) con más destino indiferenciado (Sca-1+) Relación entre segregación asimétrica y destino celular diferenciado 84%

34. Cuantificación de la expresión de Sca-1 en progenie con expresión de Desmina simétrica ~100% Consistente con resultados anteriores.

35. FACS (fluorescence-activated cell sorting) Esta técnica permite que se puedan medir varias características determinadas de una única célula mientras fluye en un líquido. Este instrumento puede recopilar información acerca de las células midiendo las emisiones de luz visible y fluorescente, lo que permite la clasificación de las células basada en características físicas, bioquímicas y antigénicas.

36. Correlación de la segregación de las hebras templado con el destino celular en progenitores miogenicos. (A) Se muestra un ploteo representativo de Sca-1 versus CldU en la población antes y después de la división celular. (B) Cuantificación de los ploteos mostrados en (A)

37. División asimétrica Stem cells musculares División simétrica Conclusiones Modelo propuesto:

38. Se puede extender la asociación de la co-segregación de las hebras templado a una gama más amplia de decisiones de las células madre mas allá de la autorrenovación. • Este sistema promete ser valioso para el estudio de los mecanismos de la herencia asimétrica de las hebras templado de ADN. • Se puede confundir la interpretación de estudios anteriores que hasta ahora han supuesto una relación geométrica simple entre la dilución del ADN marcado y la historia replicativa. • Los resultados sugieren un proceso alternativo por el cual una célula, incluso aquellas que se dividen muy rápidamente, podría incorporar el ADN marcado y generar una progenie que retenga la marcación.