In the name of God

1. In the name of God

2. Summer School Influenza Unit, Pasteur Institute of Iran summer 2011

3. SDS-PAGE Western Blotting Summer School

4. و کاربردهاSDS-PAGE • بررسی میزان خلوص پروتئین • تعیین وزن مولکولی پروتئین • شناسایی پروتئین (وسترن بلاتینگ) • شناسایی وتایید حضور باندهای دی سولفیدی • تخمین مقدار کمی پروتئین • تعیین تغییرات پس از ترجمه ای پروتئینها • و غیره ...... Summer School

5. SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate _ Polyacryl Amide Gel Electrophoresis Summer School

6. Electrophoresis Electro + Phoresis حرکت مولکولهای باردار(پروتئینها) در میدان الکتریکی که منجر به جداسازی آنها می گردد Summer School

7. عوامل موثر بر فرآیند الکتروفورز • خصوصیات فیزیکوشیمیایی مولکولها • شرایط محیط اطراف مولکولها • مولفه های میدان الکتریکی Summer School

8. خصوصیات فیزیکوشیمیایی مولکولها • شکل • اندازه • بارالکتریکی Summer School

9. شرایط محیط اطراف مولکول • بستریا محیط الکتروفورز(نوع و غلظت) • بافر(نوع ، قدرت یونی ،ظرفیت بافری وpH) • درجه حرارت محیط Summer School

10. بسترهای الکتروفورز • جامد(کاغذ،ورقه اندود شده به سیلیکاژل، آلومینا وسلولز) • نیمه جامد(پلی آکریل آمید و آگارز) • مایع Summer School

11. PAGE PolyacrylAmid Gel Electerophoresis Summer School

12. چرا بسترپلی آکریل آمید برای پروتئینها استفاده می شود؟ Summer School

13. ویژگیهای پلی آکریل آمید • از نظر شیمیایی در دماها، pHها وقدرتهای یونی مختلف پایدار است • ترکیبی بدون بار و غیرفعال است • شفاف است • قابلیت ایجاد دامنه وسیعی از منافذ را دارد • مونومرهای آن بسیار خالص هستند • و غیره... Summer School

14. ترکیب ژل پلی آکریل آمید و اجزا دخیل در پلی مریزاسیون Summer School

15. واکنش پلیمریزاسیون ژل پلی آکریل آمید • پلیمریزاسیون شیمیایی (پرسولفات آمونیوم-TEMED) • پلیمریزاسیون فوتوشیمیایی (ریبوفلاوین-TEMED)

16. عوامل موثر بر پلیمریزاسیون • پرسولفات آمونیوم (شروع کننده) • TEMED(کاتالیزور) • اکسیژن هوا (مهارکننده) • دما (ºC30-20) • زمان (بهترین زمان 60-20 دقیقه)

17. خصوصیات فیزیکی ژل پلی آکریل آمید • اندازه منافذ • الاستیسیتی • چگالی ژل • قوام مکانیکی اینها متاثر از غلظت دو جز تشکیل دهنده ژل یعنی آکریل آمید و بیس آکریل آمید است

18. Optimal Resolution Range Acrylamide PercentageSeparating Resolution 15.0% Gel 15- 45 Kd 12.5% Gel 15- 60Kd 10.0% Gel 18- 75Kd 7.5% Gel 30-120Kd 5.0% Gel 60-212Kd Summer School

19. بافرها(ژلها، نمونه و تانک) • نوع • قدرت یونی • کم باشد تا نقش یونهای نمونه در برقراری جریان زیاد باشد • بالا بردن غلظت یونی بافر افزایش توان الکتریکی و گرما • ظرفیت بافری(مقاومت در برابر تغییر pH) • pH( اگر مناسب نباشد باعث تغییراتی در پروتئین می گردد که در الکتروفورز مهم است) Summer School

20. سیستمهای بافری در ژل • پیوسته ترکیب یونی و pH بافردر تمام قسمت ها و سراسر ژل ثابت است • ناپیوسته(چند قسمتی) ترکیب یونی و pH بافردر تمام قسمت ها و سراسر ژل (Stacking &Resolving)با یکدیگرمتفاوت است Summer School

21. Stacking & Separating Gels Glycin Cl SDS-protein Stacking gel height =2 well height Summer School

22. مزیت سیستم ناپیوسته: • کارایی الکتروفورز متاثر از حجم نمونه نیست و حجم بالایی از نمونه های رقیق با این روش قابل تفکیک می باشند • پروتئینها در طی حرکت در ژل بالا یا متراکم کننده (Stacking) به صورت لایه های نازکی در آمده و سپس در ژل پایین یا جداکننده(Separating =Resolving) به اجزای خود تفکیک می شوند Summer School

23. بافر نمونه (sample buffer)

24. Sample buffer component • SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) detergent • solubilizes and denatures proteins • negative charge to proteins • 2-ME reduce disulphid bounds • Glycerol • Bromophenol Blue • Tris buffer Summer School

25. بافر تانک نقش گلایسین در بافر تانک چیست؟

26. SDS-PAGE Summer School

27. SDS Summer School

28. SDSجایگاه • در ترکیب بافرها • بافرژلها(Stacking وSeparating) • بافرنمونه(Sample buffer) • بافرتانک Summer School

29. اثر SDS بر ساختار پروتئین

30. Levels of Protein Organization • Primary structure = linear chain of amino acids • • Secondary structure = domains of repeating structures, such as β-pleated • sheets and α-helices • • Tertiary structure = 3-dimensional shape of a folded polypeptide, maintained by disulfide bonds, electrostatic interactions, hydrophobic effects • • Quaternary structure = several polypeptide chains associated together to form a functional protein Summer School

31. SDS-PAGEانواع • Denature SDS-PAGE • Non Denature SDS-PAGE زیر واحدهای همآگلوتینین ویروس آنفلوآنزا ومکان پیوندهای دی سولفیدی در ساختار آن Summer School

32. ایمنی کار • آکریل آمید و بیس آکریل آمید • TEMED • 2-ME • SDS • و ... Summer School

33. MSDS Material Safety Data Sheet Summer School

34. Biosafety of Acrylamide & Acrylamide-Bis Summer School

35. نامهاي مترادفAcrylicamide, Acrylamidemonomer,propenamide2-propenamide وزن مولكولي: 71.1 cH2=cHcoNH2 فرمول شيميايي : وضعيت ظاهري:جامد كريستالي سفيد و بي بو Summer School

36. اطلاعات عمومي سمي،آتش گير وآلوده کننده محيط زيست • اين ماده به شدت نوروتوكسين است • از راه پوست و تنفس به سرعت جذب مي شود. بر باروری اثر سوء دارد و ممكن است سبب بروز ناهنجاريهايي در جنين شود. • سرطانزا است • علايم مسموميت با آكريل آميد عبارتند از منگي و گيجي، سوزن سوزن شدن، ضعف، عدم تعادل در راه رفتن، اختلال تكلم ولرز. Summer School

37. اقدامات ایمنی • تماس با چشم : استفاده از عينك با حفاظ كناري الزامي است. اين ماده در صورت تماس با چشم مي تواند باعث سوزش چشم و ورم ملتحمه شود. • پلك چشم را كاملاً باز كرده و سريعاً چشم را به مدت 15 دقيقه با آب شستشو دهيد. در صورت مشاهده عوارض شستشو را ادامه داده و به پزشك مراجعه نمائيد. • تماس با پوست: استفاده از دستكش حفاظتي مناسب الزامي است. بهتر است از دو جفت دستكش استفاده شود. اين ماده از طريق زخم باز سريعاً وارد بدن مي شود.تماس با اين ماده باعث پوسته پوسته شدن پوست مي شود • در صورت تماس محلول يا پودر آكريل آميد با پوست، محل تماس را با آب فراوان و صابون به مدت 15 دقيقه شستشو داده و مس‍ئول ايمني را در جريان قرار دهيد. Summer School

38. اقدامات ایمنی در موارد زیر • بلعيدن-خوردن : در صورتكه فرد حجم زيادي از ماده را بلعيده باشد فرد را وادار به استفراغ كنيد اين كار با قرار دادن انگشت يا قاشق در پشت زبان امكان پذير است. فوراً به پزشك مراجعه كنيد. تذكر به فردي كه هوشيار نيست هرگز از راه خوراكي چيزي ندهيد. • تنفس : از طريق استنشاق بسيار سمي است. فرد را به هواي تازه منتقل كنيد. اگر تنفس قطع شده بود به وي تنفس مصنوعي بدهيد

39. نگهداری و ذخیره سازی • در محيطي با تهويه مناسب و خنك نگهداري شود. • در صورت بروز حريق از كپسول هاي پودر خشك شيميايي ؛ دي اكسيد كربن يا آب جهت اطفاء حريق استفاده نماييد Summer School

40. اثرات زيست محيطي و رفع آلودگي • اين ماده براي آبزيان و محيط زيست آنها بسيار خطرناك است. • در حيوانات باعث ايجاد تومور در ريه؛غده تيروئيد ، آدرنال و ... مي شود . Summer School

41. دفع پسماندهاي آكريل آميد: مواد زائد آكريل آميد شامل ژل و حوله كاغذي آلوده بايد در يك كيسه زيپ دار قرار داده شود و براي سوزاندن ارسال گردد. • رفع آلودگي سطوح : - در صورت كم بودن حجمآلودگی: آلودگي را با مواد خنثي مثل خاك؛شن؛ ماسه و يا هر ماده جاذبي كه با آن واكنش نمي دهد جمع آوري نماييد( از خاك اره استفاده نكنيد). سپس محل آلوده را با محلول سديم پر سولفات1/6% و بعد با محلول سديم بتا بي سولفات 1/6% پوشانده و بعد از 30 دقيقه با حجم زياد آب شستشو دهيد. - در صورت زياد بودن حجم آلودگی: افراد را با زدن علامت خطر بر روي درب آزمايشگاه مطلع كنيد. ازنشت ماده شيميايي جلوگیری کنید؛ تهويه مناسب را روشن نموده و فوراٌ آزمايشگاه را ترك كنيد. با اسپري نمودن آب مي توانيد غلظت بخارات آن را در هوا كم كنيد. Summer School

42. نکات ضروری • براي محلول سازي و توزين پودر آكريل آميد بايد حتماً از هود شيميايي، دستكش و ماسك استفاده کنید. • در صورت ريختن ‍‍ژل، ميز كار را با حوله كاغذي، كاغذ خشك كن يا لايه جذب كننده ديگر بپوشانيد. • گيره ها، شيشه ها و ساير لوازم جانبي سيستم الكتروفورز را بعد از استفاده كاملاً بشوييد. • ژل استفاده شده و اضافي را بعد از بستن كامل، با استفاده از دستكش در كيسه اي جداگانه قرارداده و دور بريزيد(آكريل آميد بصورت ژل كاملاً بسته شده اثر سمي كمتري دارد.) • بهتر است بجاي پودر آكريل آميد، محلول هاي آماده خريداري و مصرف شود. Summer School

43. بيس آكريل آميد(N,N'-methylenebisacrylamide) • اين ماده باعث آسيب به چشم، پوست و سيستم گوارشي ميگردد. همچنین مي تواند به سيستم عصبي مركزي و محيطي آسيب رسانده و در صورت تماس طولاني مدت با تجمع در ارگان هاي مختلف بدن سلامت فرد را به خطر اندازد.

44. اقدامات ایمنی • در تماس با چشم وپوست و تنفس مانند آكريل آميد رفتار مي كنيم • محل آلودگي را با آب و دستمال تميز كرده و آن را در سطل زباله مخصوص بريزيد. در صورت ريختن مقادير زياد از اين محلول به آن دست نزده و روي آن آب نريزيد و براي تميز كردن محل از مسئول ايمني كمك بگيريد. • در مواقع استفاده از دستكش و ماسك و لباس مخصوص استفاده شود. • محافظت شخصي: بهتر است كاربر در موقع استفاده در اتاقي با تهويه مناسب كه در آن ذرات معلق پراكنده از اين ماده به استانه خطر نمي رسند كار كند در اين اتاق مي بايستي وسايل ايمني براي شستشو چشم و بدن وجود داشته باشد Summer School

45. نگهداري بیس آکریل آمید اين ماده مي بايستي در محيط با تهويه خوب و دمای زير 25 درجه سانتی گراد نگهداري شود

46. TEMED Summer School

47. TEMED نام شيميايي:Tetramethylethylenediamine مشخصات ظاهري: محلول شفاف ، بي رنگ با بوي آميني شديد - در حالت مايع و بخار به شدت آتش گيراست. - در صورت تنفس يا بلعيدن سوزاننده است. - تماس با مقادير كم TEMED در مدت طولاني نوعي تاري ديد ایجاد می کند. اگر فردي كه در معرض بخار TEMED بوده است به سرعت به فضاي آزاد منتقل شود اين تاثير موقتي خواهد بود. Summer School

48. اجرای SDS-PAGE Summer School

49. مراحل اجرای عملی الکتروفورزSDS-PAGE • آماده سازی ژل • آماده سازی نمونه • سوارکردن ژل • نمونه گذاری • راندن نمونه در ژل • تثبیت و رنگ آمیزی نمونه ها • نگهداری ژل • تحلیل نتایج Summer School

50. آماده سازی ژل Summer School