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第二章 蛋白质

Protein. 第二章 蛋白质. 蛋白质是一类生物大分子，是生物体最重要的组成成分，其含量丰富，种类繁多。 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。. 2.1 蛋白质的构件分子. 蛋白质构件分子是氨基酸。氨基酸是蛋白质的基本单位。自然界存在的氨基酸有 300 多种，但合成蛋白质的氨基酸只有 20 种，都属于 α - 氨基酸，其中除甘氨酸外，其余都是 L- α - 氨基酸。. COOH. |. H 2 N C H. |. R.

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第二章 蛋白质

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  1. Protein 第二章 蛋白质 • 蛋白质是一类生物大分子，是生物体最重要的组成成分，其含量丰富，种类繁多。 • 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 • 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。

  2. 2.1 蛋白质的构件分子 蛋白质构件分子是氨基酸。氨基酸是蛋白质的基本单位。自然界存在的氨基酸有300多种，但合成蛋白质的氨基酸只有20种，都属于α-氨基酸，其中除甘氨酸外，其余都是L-α-氨基酸。 COOH | H2N C H | R Amino acid

  3. 蛋白质分子中的20种氨基酸在DNA分子中有它们特异的遗传密码相对应，因而也称编码氨基酸（Coding amino acid）。新近发现的硒代半胱氨酸（SeCys）也是一种编码氨基酸。

  4. 稀有氨基酸(修饰氨基酸） • 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为稀有氨基酸(非编码氨基酸）。 • 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。

  5. 非蛋白质氨基酸 也有一些不参与蛋白质的合成的氨基酸，以游离的状态存在于生物体内，称为非蛋白质氨基酸，如：L-鸟氨酸、L-瓜氨酸等。

  6. 2.2 肽键与肽链 • 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。

  7. 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状，所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状，所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。

  8. 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 • 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 • 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

  9. 四肽的结构

  10. 2.3 蛋白质的一级结构 • 蛋白质的一级结构(Primary structure)： • 多肽链上的氨基酸的种类、数目及氨基酸的排列顺序，

  11. 蛋白质一级结构的测定 • 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

  12. 1.测定蛋白质的一级结构的要求 • 1，样品必需纯（>97%以上）； • 2，知道蛋白质的分子量； • 3，知道蛋白质由几个亚基组成； • 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 • 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

  13. 2.测定步骤 蛋白质一级结构的测定 • (1)多肽链的拆分。 • 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。

  14. 蛋白质一级结构的测定 • 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). • 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

  15. 蛋白质一级结构的测定 • 通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

  16. 巯基（-SH）的保护 O ICH2CNH2

  17. 蛋白质一级结构的测定 • (2).测定蛋白质分子中多肽链的数目。 • 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

  18. 蛋白质一级结构的测定 • (3)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；

  19. (4)分析多肽链的N-末端和C-末端。 蛋白质一级结构的测定 • 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 • 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

  20. 末端基氨基酸测定 二硝基氟苯（DNFB）法 • Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 • 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 -HF

  21. 末端基氨基酸测定 丹磺酰氯法 • 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 • 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。 -HCl

  22. 末端基氨基酸测定 肼解法 • 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。

  23. 蛋白质一级结构的测定 • (5)将多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

  24. 多肽链的选择性降解 • 酶解法: • 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶

  25. 胰蛋白酶 水解位点 肽链 • Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。

  26. 糜蛋白酶 水解位点 肽链 • 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。

  27. 胃蛋白酶 水解位点 肽链 • Pepsin： • R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。

  28. C H S 3 C H 2 C H O R O - 2 B r + N H C H C N H C H C + B r C N + C H S C N 3 C H C H 2 2 C H S C N C H O R O C H O R O 3 2 2 + N H C H C N H C H C N H C H C N H C H C C H 2 H O C H O R O 2 2 + N H C H C O H N C H C + 3 ¸ 多肽链的选择性降解 • 化学法：(Cyanogen bromide) • 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。

  29. 蛋白质一级结构的测定 • (6)测定每个肽段的氨基酸顺序。 • Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺 序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

  30. 蛋白质一级结构的测定 (7)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

  31. 蛋白质一级结构的测定 (8)确定原多肽链中二硫键的位置。

  32. 二硫键位置的确定 • 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， • 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， • 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

  33. C 端 N 端 肽单位 肽单位 2.4 蛋白质的高级结构 2.4.1 肽单位平面结构和二面角 肽单位： 主肽链中的重复单位

  34.  肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。 形成的原因： p－共轭，肽键不能自由旋转 结果：形成刚性平面

  35. 二面角 二面角

  36. 四级结构 2.4.2. 蛋白质结构层次 三级结构 结构域 超二级结构 二级结构 一级结构

  37. 2.4.3 蛋白质的二级结构 • 蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 • 主要有-螺旋、-折叠、-转角、 此外还有-发夹、无规卷曲等。

  38. （1）-螺旋-helix • 在-螺旋中肽平面的键长和键角一定； • 肽键的原子排列呈反式构型； • 相邻的肽平面构成两面角；

  39. （1）-螺旋 • 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm; • 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键（包含13个原子）。 • 蛋白质分子为右手-螺旋。

  40. -螺旋

  41. 表 几种螺旋结构参数 结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） ΦΨ 310螺旋 3.0 10 0.2 -49 -26 α-螺旋 3.6 13 0.15 -57 -47 （3.613螺旋） β-螺旋 4.4 16 0.12 -57 -70 （4.416螺旋）

  42. 角蛋白分子

  43. （2）-折叠 -pleated sheet • -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象 • 在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；

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