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专题１基因工程. 基因工程的基本操作程序. 1.2 基因工程的基本操作程序. 一、目的基因的获取. 获取目的基因是实施基因工程的第一步。 目的基因主要是指 ______________________ 获取目的基因的常用方法 ①从基因文库中获取 （基因组文库，部分基因文库） ②利用 PCR 技术扩增目的基因 （变性，复性，延伸） ③通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成. 编码蛋白质的结构基因. （一）从基因文库中获得目的基因. 1. 基因文库
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专题１基因工程 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 • 获取目的基因是实施基因工程的第一步。 • 目的基因主要是指______________________ • 获取目的基因的常用方法 • ①从基因文库中获取 （基因组文库，部分基因文库） • ②利用PCR技术扩增目的基因 （变性，复性，延伸） • ③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 编码蛋白质的结构基因
（一）从基因文库中获得目的基因 1.基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 基因组文库 基因文库 部分基因文库（如:cDNA文库）
（一）从基因文库中获得目的基因 2.基因文库的构建方法 ①鸟枪法： （直接分离法） 供体细胞中的DNA 目的基因 限制酶 分离 产生特定性状 许多DNA片段 与载体连接载入 外源DNA扩增 受体细胞 运载体 导入
①直接分离法 基因组文库的构建 IMN
补：原核细胞的基因结构 IMN 非编码区 非编码区 编码区 编码区下游 编码区上游 启动子 终止子 与RNA聚酶结合位点 编码区 编码蛋白质 ,连续不间断 非编码区 不编码蛋白质，有调控作用
补：真核细胞的基因结构 IMN 编码区 非编码区 非编码区 编码区下游 编码区上游 启动子 终止子 与RNA聚合酶 结合位点 外显子 内含子 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 编码区 非编码区 不编码蛋白质，有调控作用
（一）从基因文库中获得目的基因 ②反转录法： 目的基因的mRNA 反转录酶 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (目的基因)
（一）从基因文库中获得目的基因 2.基因文库的构建方法 ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 操作简便广泛使用 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性较强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 专一性最强
（二）利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制_____________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 DNA复制 ②原理：__________ 已知基因的核苷酸序列 ③条件：_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________ 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 2n ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 指数 ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
IMN 6 过程： 变性、退火、延伸三步曲 变性 延伸 退火
(三). 通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成 IMN 基因_____，核苷酸序列______ 。 较小 已知
二、基因表达载体的构建 限制酶 1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。 2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。 黏性末端 同一种限制酶 相同的黏性末端 切口 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量_____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） DNA连接酶
二、基因表达载体的构建 4.过程: 质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
二、基因表达载体的构建 5.基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建 基因表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基因 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端， 是RNA聚合酶识别和结合的部位。 终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA 片段，使转录在所需要的地方停止下来。 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
三、将目的基因导入受体细胞 受体细胞 转化 —— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 稳定 表达 农杆菌转化法 将目的基因导入 植物细胞 基因枪法 花粉管通道法 将目的基因导入 动物细胞 方法 ——显微注射法 将目的基因导入 微生物细胞 ——感受态细胞
三、将目的基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法 （1）农杆菌介绍 （2）原理及适用范围
三、将目的基因导入受体细胞 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）常用大肠杆菌： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 （2）大肠杆菌的转化方法 • 首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
四、目的基因的检测与鉴定 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 检测 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
随堂练习 C 1）以下说法正确的是 A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
随堂练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D
随堂练习 A 3）有关基因工程的叙述中，错误的是 A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
随堂练习 D 4）有关基因工程的叙述正确的是 A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
随堂练习 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C
