Download
1 / 22
230 likes | 426 Vues
Polymorfizm us ľudskej DNA. Andrej Ficek. Genetický polymorfizmus. Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej dvomi diskontinuitnými variantmi v jednej populácii, pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako 1%
E N D
Polymorfizmusľudskej DNA Andrej Ficek Katedra molekulárnej biológie
Genetický polymorfizmus • Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej dvomi diskontinuitnými variantmi v jednej populácii, pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako 1% • Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitnú variabilitu, polytypizmy, zriedkavé znaky (dedičné choroby) • Typy polymorfizmu: • morofologický • funkčný • serologický • biochemický • DNA: je najčastejší, lebo väčšina polymorfizmov DNA nemá fenotypový prejav
Typy DNA polymorfizmov • Bodový polymorfizmus - substitúcie jednotlivých báz (SNP – single nucleotide polymorphism) • Variabilný počet tandemových repetícií • mikrosatelity (STR – short tandem repeat) • minisatelity (VNTR – variable number of tandem repeats) • Prítomnosť/neprítomnosť sekvencie (Alu, L1 a i.) na špecifickom mieste (indel)
Bodový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) .... CTCGACTTT...... .... CTCGTCTTT...... • Početnosť: 1 : 1000 bp; v genóme cca 3 mil., • Výskyt: intróny, nekódujúce oblasti (väčšinou žiadny fenotyp); len asi 50 000 v kódujúcich sekvenciách génov • Vznik: mutácia + genetický drift; nepoznáme pôvodný stav, len nepriamo (zo sekvencie u primátov); • Mutačná rýchlosť nízka: µ = 10-7 až 10-9 (najčastejšie v dinukl. CpG) • Ak zámena spôsobí vznik/zánik restrikčného miesta, je možná analýza tohto polymorfizmu metódou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ......GGTATC..... ......GGTACC..... - vznik cieľového miesta pre restr. endonukleázu KpnI
Detekcia SNP polymorfizmu • RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) - restrikčné štiepenie genomickej DNA s následným Southern blottingom (dni) - PCR amplifikácia s následným restrikčným štiepením (deň) • DNA chip analýza až 100 tisíc SNP v jednej analýze sonda
....(TGAC)(TGAC)(TGAC)....... ....(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)......... Detekcia PCR amplifikáciou konkrétneho polymorfizmu a separáciou v géli Polymorfizmus variabilného počtu tandemových opakovaní
Polymorfizmus variabilného počtu tandemových repetícií Mikrosatelity (STR) • Dĺžka základnej repetície 2-6bp • Počet opakovaní repetície 1 – 100 • Výskyt rovnomerne po genóme • Odhadovaný počet rádovo 105 • Jednoduchá detekcia: PCR • Vznik nových alel: replikačné chyby • Mutačná frekvencia: cca 10-3 • Využitie: rozsiahle; individuálna identifikácia, nepriama DNA diagnostika, identifikácia génov • Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA • Výnimka: expanzie trinukleotidov u niektorých ochorení • Najčastejší: „CA-repeat“ (asi 50 000 x v genóme) Minisatelity (VNTR) • Dĺžka základnej repetície >6bp • Počet opakovaní repetície 10 – 100 (1000) • Výskyt preferenčne v telomérických oblastiach (najmä bohaté na GC páry) • Odhadovaný počet: cca 104 • Jednoduchá detekcia: Southern, PCR • Vznik nových alel: nehomologický crossover • Mutačná frekvencia: vysoká, až 10-3 • Využitie: obmedzené; individuálna identifikácia • Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA • Špec. prípad: minisatelit (TTAGGG)n - teloméry
Inzerčno-delečný polymorfizmus (indel) • Indel od 1 bp po niekoľko Mb • inzercie Alu, L1 – retrotranspozícia • Veľmi zriedkavý jav: unikátne udalosti • Poznáme pôvodný stav (bez inzercie) • Inzercie (Alu, L1) aj do kódujúcich sekvencií → patológia
Praktické využitie DNA polymorfizmov • identifikácia osôb a určovanie paternity, • identifikácia neznámych génov zodpovedných za genetické ochorenia, • nepriama dg. monogénnych ochorení, • evolučné štúdie (polymorfizmy mtDNA a Y-chrom. DNA
Individuálna identifikácia „DNA fingerprint“ • Alec Jeffreys, 1984 • Restrikčné štiepenie genomickej DNA → elektroforetická separácia → Southernov blotting s VNTR próbou (GGGCAGGAXG)
PCR amplifikácia VNTR polymorfizmu • analýza konkrétneho polymorfizmu/lokusu pomocou špecifických primerov primery
Multiplex PCR • Amplifikácia viacerých lokusov v jednej PCR reakcii vľavo - separácia na akrylamidovom géli a vizualizácia striebrom vpravo - fluorescenčné značenie polymorfizmov a kapilárová elektroforéza
Mikrosatelity variabilita v populácii • Genotypy troch ľudí v štyroch STR polymorfizmoch (fluorescenčné značenie a kapilárová elektroforéza) D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO Jedinci 1. 2. 3.
Identifikácia osôb • Multiplex PCR 16 fluorescenčne značných mikrosatelitových polymorfizmov • Pravdepodobnosť identity dvoch náhodných jedincov 10-17
Polymorfizmy Y-chromozómu a mtDNA pri štúdiu evolúcie H.sapiens • Mt a Y-DNA nepodstupuje rekombinácii, polymorfizmy sú prenášané spolu a tvoria haplotyp so samostatnou históriou, • Dedia sa uniparentálne, poskytujú možnosť sledovať individuálne maternálne/paternálne línie – migrácie ľudských skupín, • Mutačná rýchlosť ideálna pre relatívne krátku evolúciu anat. mod. človeka, umožnuje datovanie recentných udalostí, osídľovanie kontinentov (SNP, in-del aj STR polymorfizmy),
Štruktúra mtDNA • kruhová 2-vláknová molekula, 16 569 bp • predstavuje 1/200 000 veľkosti jadrového genómu • niekoľko 100-1000 kópií na bunku • Kódujúce oblasti - 93 % 37 tesne usporiadaných génov • Kontrolná oblasť - 7 % približne 1200bp hypervariabilné segmenty HVSI (CRS:np 16024-16383) a HVSII (np 57-372)
Štruktúra chromozómu Y • 60 Mb dlhá lineárna molekula DNA • 95% predstavuje NRY/NRPY – non-recombining region/portion of Y) • Heterochromatín: 6 rôznych typov sekvencii v tandemových zoskupeniach • Euchromatín: X-transponované, X-degenerované a amplikonické segmenty • 156 transkripčných jednotiek, 27 proteínových rodín (12 vo všetkých tkanivách, 11 špecifických pre testes)
Polymorfizmy mt a Y-chr. DNA Polymorfizmy na Y-chromozóme Bialelické markery (binárne) • SNP, inzerčno-delečné polymorfizmy, vyskytli sa v evolúcii len raz – definujú jednotlivé haploskupiny • Nízka mutačná rýchlosť 10-8/báza/ generácia) Multialelické markery • Mikrosatelity - STR polymorfizmy (menej ako 10bp) a minisatelity - VNTR polymorfizmy (10-100bp) • Vysoká mutačná rýchlosť (6,9 x 10-4/ generáciu) • Počet opakovaní – definuje haplotyp • stanovenie diverzity, odhad veku haploskupiny Polymorfizmy mitochondriálnej DNA • SNP a in-del polymorfizmy v kódujúcej oblasti (definujú haploskupinu) a kontrolnej oblasti (HVSI a II – definujú haplotyp) • Celková mutačná rýchlosť je asi 10x vyššia ako v jadrovej DNA, výrazne varíruje v rámci molekuly • Synonymické pozície a oblasti HVSI,II sa menia 5-10x rýchlejšie (1,4x10-6/ bp/gen.) ako nesynonymické nps génových oblastí, tRNA a rRNA gény (3,4x10-7/bp/gen.) • „mutation hot-spots“ - spätné a paralelné mutácie (homoplázia)
Prenos mtDNA, Y-chromozálnej DNA a autozomálnej DNA mtDNA a Y-DNA: žiadna rekombinácia Pred 5 generáciami mal každý jedinec 25 = 32 predkov, z nich len od jedného zdedil Y, od jedného mtDNA, ale od všetkých autozomálnu DNA prenos „en bloc“ cez generácie Každý má práve jedného Y-predka a jedného mt predka v každej predošlej generácii Matka Otec Dieťa
Koalescencia línií mtDNA a Y-DNA„mitochondriálna Eva“ • Možno nájsť spoločného predka pre členov populácie, pretože • v každej generácii dôjde k zániku a naopak k zmnoženiu niektorých línií, • a po čase v rovnovážnej populácii prevládne mt/Y DNA odvodené od jedného spoločného predka
Rozšírenie H. sapiens – osídľovanie kontinentovHypotéza „Out of Africa“ • spoločný predok všetkých dnešných ľudí žil v Afrike približne pred 150 000 rokmi, • posledný spoločný predok pre africké a neafrické mtDNA Y-DNA žil pred asi 100 000 rokmi – migrácia anatomicky moderných do Ázie a Európy pred cca 60 – 40 tis. rokmi, • nahradenie populácií H. erectus (H. ergaster, H. heidelbergensis, H. e. javensis atď) moderným H. sapiens afrického pôvodu, • celá súčasná variabilita mtDNA je najväčšia medzi africkými populáciami, • všetky ostatné mtDNA typy sú odvodené od pôvodných haploskupín nájdených v Afrike.
