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基因工程 第三讲： DNA 纯化后的利用. Manipulation of Purified DNA. 讲课提纲. 3.1 DNA 操作使用酶 3.2 切割 DNA 的酶 — 限制性内切酶 3.3 连接 - 将 DNA 分子连接到一起. 3.1 DNA 操作使用酶. 为了得到重组 DNA 分子，载体分子和将要被克隆的 DNA 都必须在特定的位点被切开，并以可控方式连接在一起。 另外，还可以对 DNA 进行： 切短和延长， 转录成 RNA 或复制成新的 DNA 分子， 添加或去除一些化学基团而修饰。
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基因工程第三讲： DNA纯化后的利用 Manipulation of Purified DNA
讲课提纲 3.1 DNA操作使用酶 3.2 切割DNA的酶—限制性内切酶 3.3 连接-将DNA分子连接到一起
3.1 DNA操作使用酶 为了得到重组DNA分子，载体分子和将要被克隆的DNA都必须在特定的位点被切开，并以可控方式连接在一起。 另外，还可以对DNA进行： 切短和延长， 转录成RNA或复制成新的DNA分子， 添加或去除一些化学基团而修饰。 研究生化性质、基因结构和控制基因表达的。
几乎所有的DNA操作都要使用纯净的酶。 酶： 在细胞内参加各种基本反应； 从细胞提取纯化后，能够在人工条件下，催化其天然反应，或类似的反应。 这些酶促反应大多数无法用化学方法实现。因此纯化的酶对于基因工程是非常关键的，其制备、性质研究和市场买卖已经形成了一个重要的产业。
依赖于基因克隆的DNA： 切开_限制性内切酶(restriction endonuleases) 连接_连接酶(ligases) 本讲的绝大部分就这两种酶的使用方法进行介绍。
DNA操作酶的范围 DNA操作酶根据其催化反应的类型分为5大类： (1)核酸酶：切开、切除或降解； (2)连接酶：将核酸分子连接起来； (3)聚合酶：复制核酸分子； (4)修饰酶：去除或添加化学基团； (5)拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或消除超螺旋。
在分析这些酶的分类前，有两点必须明确： 首先，尽管绝大多数酶能够被分到特定的类别中，但有一小部分表现出多重活性而横跨两个或两个以上的类别。 如：很多能够合成新DNA链的聚合酶，同时也表现出DNA水解酶的活性。
其次，有许多与DNA酶相似的RNA酶，用于在DNA制备实验中除去造成污染的RNA。其次，有许多与DNA酶相似的RNA酶，用于在DNA制备实验中除去造成污染的RNA。 随后的章节中将介绍一些RNA操作酶， 但重点是DNA操作酶。
3.1.1 核酸酶 核酸酶通过打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键来水解DNA分子。 分为两种: (1)外切核酸酶(exonuleases)：从DNA分子的末端一个个地切除核苷酸。 (2)内切核酸酶(endonuleases)：在一个DNA分子内部打开磷酸二酯键。
不同的外切核酸酶之间的主要区别： 当双链DNA分子被攻击时，外切核酸酶会切开其中的一条链或是把两条链都切断。 典型外切核酸酶Bal31： 能够切开双链DNA分子的两条链， 作用时间越久，所制得的DNA片段就越短。 相反，大肠杆菌外切核酸酶Ⅲ：只能够切开DNA双链中的某一条链，最后得到单链的DNA分子。
同样的规则也可用于对内切核酸酶进行分类。 S1内切核酸酶：只切单链； DNase I(脱氧核糖核酸酶I)：切双链和单链。 一种非特异性内切酶，能够打破所攻击的DNA内部的任意磷酸二酯键连接。 延长DNase I作用时间后得到的是单核苷酸和寡核苷酸的混合物。 限制性内切酶：能够在有限的特定位点切开双链DNA。
3.1.2连接酶 细胞中连接酶的作用: 修复单链上的切口(‘断裂’)，这些断裂是在双链DNA分子的复制过程中出现的。 从有机体中提取的DNA连接酶: 修复单链上的切口; 还能够连接两条双链DNA片段(图4-4)。
3.1.3聚合酶 DNA聚合酶： 能够合成一条与已知模板DNA或RNA互补的新DNA链。 只有当模板(template)具有双链区域充当聚合反应起始引物(primer)时，绝大多数聚合酶才能够发挥作用。 基因工程中通常用到的有4种DNA聚合酶。
第一种：DNA聚合酶I 通常从大肠杆菌中制得。 当DNA分子主要由双链构成但存在一段短的单链区域（或缺口）时， DNA聚合酶I与单链区域相结合，并合成一条全新的链，与此同时降解掉原来存在但被代替掉的那段DNA序列。 因此DNA聚合酶I是典型的具备双重酶活性酶： 既具备DNA合成酶活性也具备DNA水解酶活性。
DNA聚合酶I的聚合酶活性和水解酶活性是受酶分子不同部位控制。DNA聚合酶I的聚合酶活性和水解酶活性是受酶分子不同部位控制。 水解酶活性包含在多肽链前223个氨基酸中。 因此切掉此部分后所得到的修饰后的酶， 虽然还保留DNA聚合酶活性，但是不能再水解DNA。 这种DNA聚合酶I修饰后的酶，称作Klenow片段。
Klenow片段 能够结合在单链模板上合成一条互补DNA链； 因为已失去DNA水解酶活性，一旦填满缺口合成就无法继续进行。 一些其他的酶，天然状态和修饰后状态，都和Klenow片段有着相似的性质。
Taq DNA聚合酶 是细菌Thermus aquaticus中的DNA聚合酶I。 这种细菌生活在温度很高温泉中，因此它的很多酶，包括Taq DNA聚合酶都是热稳定性的， 意味着它们能够在热处理的条件下保证不会发生变性。正是这一特殊性质使得Taq DNA聚合酶适合用于PCR反应，因为如果不具有热稳定性，当反应温度升到94℃使DNA变性时，聚合酶也会发生变性而失活。
逆转录酶 一种在一些病毒复制中出现的酶。 独一无二的特点： 所用到的模板是RNA而非DNA。 这种以一条RNA为模板合成互补DNA链的方法是一项称为互补DNA(cDNA)克隆技术的核心。
3.1.4 DNA修饰酶（modifying enzymes） 通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，统称为DNA修饰酶。 最重要的： (1)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 从大肠杆菌、牛小肠组织、北极虾中提取， 能去除DNA分子5’末端的磷酸基团。
(2)多核苷酸激酶(polynucleotide kinase) 从T4噬菌体侵染的大肠杆菌中提取， 和碱性磷酸酶的活性相反，在DNA分子5’游离末端添加磷酸基团。 (3)末端脱氧核苷酰转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase) 从小牛胸腺组织中提取， 在DNA分子3’末端添加一个或多个脱氧核苷酸。
3.1.5 拓扑异构酶(topoisomerases) 能够通过引入或去除超螺旋来改变共价闭合环状DNA(如：质粒DNA分子)的构象。 尽管它的重要性主要体现在DNA复制的研究中，但在基因工程中也占据一席之地。
3.2 切割DNA的酶—限制性内切酶 基因克隆要求DNA分子以一种准确的并且是可重复的方式被切割。 每一个载体都必须在一个单一位点被切割，以打开环使新的DNA能够被插入进去; 一个分子如果被切割了超过一次，将会断裂成两个或更多的互相分离的片段，这些片段是无法作为分子克隆载体的； 每个载体分子必须在环中的同一位置被切割开，随机切割不会令人满意。
通常情况下，需要对克隆的DNA进行切割。 首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含2-3kb DNA，则这个基因不得不从大的(通常情况下超过80kb)DNA分子中切割出来。 其次，大的DNA分子不得不被切断成小的足以被载体携带的片段。 绝大多数克隆载体能够承载的DNA片段处于一个特定的大小范围中。 比如，以M13噬菌体为基础的载体，所克隆的DNA分子超过3kb时运载效率非常低。
纯化后的限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复的方式切割基因克隆所需的DNA分子。纯化后的限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复的方式切割基因克隆所需的DNA分子。 这些酶的发现使W. Arber. H. Smith和D. Nathans荣获1978年的诺贝尔奖。也是基因工程发展过程中的一项突破性进展。
3.2.1限制性内切酶的发现和其功能 20世纪50年代，观察到有一些细菌菌株对噬菌体的侵染表现出免疫力，这种现象称之为宿主调控性限制。 尽管全面理解限制的机制花费了20多年的时间，但其实并不复杂。 原因：细菌产生出一种能够在噬菌体DNA进行复制和合成新的噬菌体颗粒前就将其降解的酶。 细菌本身的DNA却不受这种攻击的影响，否则是致命的。因为细菌本身携带有额外的甲基基团阻断了降解酶的活动。
这些降解酶被称作限制性内切酶，能够为很多的细菌所合成。这些降解酶被称作限制性内切酶，能够为很多的细菌所合成。 已有超过1200种、三大类 三大类区别主要是作用模式上微小的不同。 限制性内切酶I和Ⅲ结构上要复杂得多，并且在基因工程中只承担很少的角色。 限制性内切酶Ⅱ是基因克隆中要用到的非常重要的切割酶。
3.2.2限制性内切酶Ⅱ （简称为限制性内切酶）核心特征： 每种酶都有一段特定的识别序列，在这段序列上它们才能够切割DNA分子。 PvuI(从Proteus vulgaris中分离)切割CGATCG， 同一细菌分离的另外一种酶PvuⅡ，是CAGCTG。 很多限制性内切酶能够识别六核苷酸目标位点， 另一些识别四、五、八等核苷酸序列位点。 如：Sau3A能够识别GATC， AluI在AGCT位点进行切割。
有许多具有非保守识别位点的限制性内切酶， 意味着它们能够在相关位点构成的家族中的任意位点切割DNA。 比如：HinfI，识别GANTC， 能够在GAATC，GATTC，GAGTC和GACTC切割。 一些最频繁使用的限制性内切酶的限制序列在表4-1中列出。
3.2.3平末端和黏末端 限制性内切酶切割的确切性质在设计基因克隆实验中具有显著的重要性。 许多限制性内切酶在识别序列处产生简单的双链断口。得到平末端或平端(blunt end或flush end) PvuⅡ和AluI是平末端内切酶的典型例子。
还有大量的限制性内切酶切割DNA方式不同。 DNA的两条链在不同的位置被切开，形成一种交错的切口，通常会隔开2或4个核苷酸， 因此，所得的DNA片断在末端都具有短的悬垂部分。 这些被称作黏末端(sticky or cohesive ends)或黏性末端。 黏末端之间的碱基配对能够将DNA分子重新连接起来。
黏末端酶的一个重要特征是： 不同识别位点的限制性内切酶能够产生出相同的黏末端。 BamHI(识别序列GGATCC)、BglⅡ(识别AGATCT) 和Sau3A(识别序列GATC) 都能够产生GATC黏末端。 经这些酶切割产生的DNA片段，都能够通过每一个片段所携带的互补黏末端连接在一起。
3.2.4 DNA分子中识别序列的出现频率 对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的DNA分子中,识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。 这一算法假定核苷酸以一种随机方式排列而4个不同核苷酸以相同的比例出现(例如GC含量：50％)。 一个四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256个核苷酸出现一次。 实际上，这些假设不可能完全有效。
如，λDNA分子，49kb， GC的含量要少于50％。 对一个六核苷酸识别序列的限制性内切酶来说应该具有12个酶切位点。 实际上，这些识别位点发生的频率要小一些， 如：BglⅡ有6个， BamHI有5个， SalI则只有2个。
限制性位点通常不会均匀分布于DNA分子中。 如果它们是均匀分布的，那么用一种特定的限制性内切酶消化后所得的片段应该是一样长的。图4-10(b)给出的就是用召BglⅡ，BamHI，SalI对λDNA进行切割后得到的片段。 在每一种酶切中，都能够看到片段在一定范围内存在着变化，这表明入DNA中核苷酸并非完全随机地进行排列。
从图4-10中我们能够学到的是: 尽管数学方法可以就一个给定的DNA分子，来推断究竟能够出现多少个限制性位点， 但是只有实验分析法才能够给出准确的结果。因此我们必须继续考虑在实验室中如何使用限制性内切酶。
3.2.5实验室条件下的限制性酶切 以BglⅡ (125µg/ml )对λDNA样品的消化为例： 1.取DNA： DNA用量取决于实验本身的要求，用微量移液器。 假设：需要消化2µg λDNA 2.为内切酶提供一个合适的环境(buffer)。 所有限制性内切酶Ⅱ都需要在镁离子存在下才发挥作用。 离子强度通常由氯化钠(NaCl)提供。 不当的环境，不仅会降低限制性内切酶的活性，还会导致酶的专一性的改变，使DNA切割额外的、非标准的识别序列。
绝大多数限制性内切酶的最适pH在7.4左右， 不同的酶对离子强度和镁离子(Mg2+）浓度的要求不尽相同。 加入一个还原剂也是明智的做法，比如二硫苏糖醇(DTT)，它能够使内切酶稳定并防止其失活。 BglⅡ合适的缓冲液的成分在表4-2中排列出来。 这里列出的缓冲液是工作浓度的10倍，在加入反应混合液的过程中被稀释。 本例子中，一个反应混合液的合适的终体积是20uL,因此我们加入2µL的10×BglⅡ缓冲液到16µL的已经配制好的DNA溶液中。
3. 限制性内切酶： 供应商提供纯的已知浓度的溶液。 1个酶单位： 被定义为在1h中切割1µgDNA所需要的酶量。 所以，需要2个单位的BglⅡ来切割2µg的λDNA。 BglⅡ通常是以4单位/µL的浓度，本实验0.5µL足够。 因此反应混合物中加入0.5µL酶和1.5uL水， 达到20µL的最终体积。
