Rozwój myszy z wyjądrzonych oocytów, do których wprowadzono jądra komórek pęcherzykowych

1. Rozwój myszy z wyjądrzonych oocytów, do których wprowadzono jądra komórek pęcherzykowych Wakayama,T., Perry, A.C.F., Zuccotti, M., Johnson, K.R., Yanagimachi, R. Nature 394, 369-374 (1998)

2. Wstęp: • Pierwsze udane doświadczenia z klonowaniem ssaków opierały się na przeszczepianiu przedjądrzy 1-komórkowych zarodków myszy (McGrath&Solter, 1983). • Dalsze prace prowadzone były na oocytach owcy, bydła domowego i królika, efektem było uzyskanie klonów w wyniku transplantacji jąder pochodzących z bruzdkujących zarodków lub węzłów zarodkowych. • Próby uzyskania klonów będących genetycznymi kopiami dorosłych osobników  owca Dolly powstała w wyniku przeszczepienia do oocytu komórki gruczołu mlekowego 6-letniej owcy (Wilmut i współaut., 1997). • Wiadomo, że najlepsze efekty przynosi przeszczepianie jąder komórek znajdujących się w fazie G0.

3. Cel doświadczenia: • Zbadanie czynników wpływających na rozwój embrionów powstałych z wyjądrzonych oocytów, do których przeszczepiono jądra w pełni zróżnicowanych komórek somatycznych. • Wykorzystane komórki (Sertoliego, nerwowe i pęcherzykowe) nie pochodziły z hodowli tkankowych.

4. Materiał i metody: • Komórki pęcherzykowe pobrano od samic szczepu B6D2F1 (seria A i B) oraz B6C3F1 (seria C), u których wywołano superowulację poprzez podanie hormonów eCG i hCG, komórki pęcherzykowe oddzielono od oocytów w roztworze hialuronidazy. • Wyselekcjonowano komórki o wielkości 10-12 µm, przechowywano je do 3h w HEPES-CZB zawierającym 10% poliwinylopirolidonu. • Komórki Sertoliego izolowano od samców szczepu B6D2F1 i przechowywano w HEPES-Ham F-12. • Neurony izolowano z kory mózgu samicy B6D2F1 ( jądra o średnicy 7-8 µm). • Wszystkie komórki somatyczne powinny być w fazie G0.

5. Materiał i metody – c.d. • Oocyty pobierano od samic szczepu B6D2F1, którym podano eCG, a 13h przed zabiciem – hCG. • Mikromanipulacji dokonywano przy pomocy mikromanipulatora piezoelektrycznego w kropli HEPES-CZB zawierającego 5 µg/ml cytocholazyny B ( jej obecność zapobiegała wyrzucaniu II ciałka kierunkowego). • Chromosomy II metafazy wraz z wrzecionem podziałowym usuwano poprzez wciągnięcie ich do pipety z minimalną ilością cytoplazmy i oderwanie od oocytu. • Następnie wyjądrzone oocyty przenoszono do pożywki niezawierającej cytocholazyny B i przechowywane do 2h w temperaturze 37,5oC.

6. Materiał i metody – c.d. • Jądra komórek somatycznych oczyszczano z cytoplazmy przy pomocy pipety o średnicy 7 µm i w ciągu 5 min wszczepiano do wyjądrzonego oocytu. • Oocyty aktywowano w obecności 10 mM Sr2+ w dwóch grupach: pierwszą grupę od razu po przeszczepieniu jąder, drugą grupę w ciągu 1-6 h, wszystkie oocyty przechowywano w pożywce zawierającej cytocholazynę B. • Zarodki w stadium 2-8 komórek wszczepiano do jajowodów/macic samic szczepu CD-1, pokrytych 1-3 dni wcześniej sterylnymi samcami szczepu CD-1.

7. Wyniki: • W pierwszym eksperymencie oocyty z jądrami komórek pęcherzykowych aktywowano w różnym czasie od momentu przeszczepienia jąder i okazało się, że moment aktywacji ma istotne znaczenie dla rozwoju zarodków. • Ok. 40% oocytów aktywowanych od razu rozwinęło się do stadium moruli/blastocyty. • Stadium moruli/blastocysty osiagnęło 60% oocytów aktywowanych 1-3h po transplantacji jąder i 67% oocytów aktywowanych 3-6h po transplantacji jąder. • Wśród wszystkich aktywowanych oocytów 64% miało dwa przedjądrza, 36% - trzy lub wiecej. • Obecność cytocholazyny B zablokowała tworzenie II ciałka kierunkowego. • Analiza chromosomów 13 aktywowanych oocytów wykazała, że 85% z nich ma prawidłową liczbę chromosomów 2n=40.

8. oocyt otoczony przez komórki pęcherzykowe b)-e) jądra pochodzące z komórek pęcherzykowych po przeszczepieniu do wyjądrzonego oocytu f) blastocysty

9. Wyniki – c.d. • Na bazie tych informacji oocyty, do których przeszczepiono jądra komórek Sertoliego i komórek nerwowych, aktywowano 1-6h po transplantacji jąder. • Oocyty z jądrami komórek Sertoliego: 40% rozwinęło się do stadium moruli/blastuli, z tego jeden płód rozwijał się przez 8,5 dnia po zapłodnieniu w macicy, potem został uśmiercony. • Oocyty z jadrami komórek nerwowych: 22% osiągnęło stadium moruli/blastocysty, jeden zarodek rozwijał się w macicy, ale obumarł ok. 6-7 dnia po zapłodnieniu. • Ponieważ wyniki pierwszego doświadczenia z przeszczepionymi jądrami komórek pęcherzykowych były bardziej obiecujące, autorzy pracy skupili się na oocytach, do których przeszczepiali jądra tych właśnie komórek.

10. Wyniki – c.d.

11. Cumulina ur. 3.10.1997 • Cumulina w wieku 2,5 miesiąca z własnym potomstwem (ojciec ze szczepu CD-1) • Myszy agouti będące klonami dawczyni komórek pęcherzykowych ze szczepu B6C3F1, w środku „matka zastępcza”, z prawej strony – dawczyni oocytów.

12. Wyniki – c.d. Dowody na to, że uzyskane myszy są klonami dawczyń komórek pęcherzykowych i nie mają zanieczyszczeń genetycznych: 1)Oocyty nie były wystawione na działanie plemników in vitro. 2)Matki zastępcze (CD-1) zostały pokryte sterylnymi samcami (CD-1),poza tym, nawet, gdyby doszło do zapłodnienia, potomstwo byłoby białe. Poza tym, samicom wszczepiano zarodki 2-8 dniowe, a zapłodnienie na tym etapie nie jest możliwe. 3)Wszystkie urodzone myszy miały czarne oczy, myszy z serii B miały czarne futro, a myszy z serii C i D – futro agouti. W każdym przypadku otrzymano spodziewany fenotyp. 4)Wszystkie urodzone myszy były samicami.

13. Wyniki – c.d. 5) Wyniki Southern blot. 6) Gdyby jądra nie zostały usunięte całkowicie, powstałe zarodki byłyby hiperploidalne i nie przeszłyby pełnego rozwoju. 7) Przeprowadzono dodatkowy test polegający na usunięciu jader z 204 oocytów, w żadnym z nich nie zaobserwowano pojawienia się chromosomów.

14. Wnioski: • Odstęp czasowy pomiędzy przeszczepieniem jądra i aktywacją jest korzystny dla rozwoju zarówno pre- jak i postimplantancyjnego. • Może to być związane z wystawieniem na „działanie” cytoplazmy bogatej w MPF, niewykluczone, że w chromatynie zachodzą zmiany epigenetyczne istotne dla dalszego rozwoju zarodka. • Użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego pozwala na przeprowadzanie szybkich i wydajnych manipulacji na komórkach i ogranicza śmiertelność zarodków. • Nie wiadomo, dlaczego nie udało się uzyskać pełnego rozwoju zarodków z jądrami komórek Sertoliego i nerwowych, możliwe, że stadium fazy G0, w którym się znajdowały nie pozwala na podtrzymanie rozwoju zarodka. • Niewielka liczba urodzeń (2-3%) w stosunku do ilości implantowanych zarodków (57-71%) wskazuje na to, że w rozwój postimplantacyjny mogą być zaangażowane liczne czynniki regulatorowe i punkty kontrolne. • Ssaki można klonować, ale wydajność jest dosyć niska.

15. KONIEC