Download
a funkcion lis genomik ban rejl potenci lok n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
A funkcionális genomikában rejlő potenciálok PowerPoint Presentation
Download Presentation
A funkcionális genomikában rejlő potenciálok

A funkcionális genomikában rejlő potenciálok

55 Vues Download Presentation
Télécharger la présentation

A funkcionális genomikában rejlő potenciálok

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. A funkcionális genomikában rejlő potenciálok Lars M. Steinmetz és Ronald W. Davies cikke alapján Horvát Sándor, IV. éves biológus értelmezésében

  2. A genomiális információ megismerésével a biológia új korszakba ért. A funkcionális genomika eszközeivel választ kaphatunk olyan kérdésekre, mint pl.: -Mikor expresszálódik egy gén? -Hol lokalizálódik a terméke? -Milyen más géntermékekkel kerül interakcióba? -Milyenfentotípust eredményez a gén mutációja?

  3. A genom project-ek nagy mértékben segítették a funkcionális genomika, különösen a DNS microarray (DNS chip) technológia fejlődését, elterjedését. Az igazi genom éra akkor köszönt be, amikor elsősorban a szekvencia adatokból következtethetünk a funkcionális információra.

  4. A génfunkció megállapításának hatékony módja a mutánsok analízise A génfunkció megváltoztatható: -delécióval -inszerciós mutagenezissel -RNS interferenciával

  5. Eltávolítódik a célzott gén, így a funkcionális redukció teljes Élesztőben, egérben jól használható Újabban Drosophilában is alkalmazzák Nem működik hatékonyan C. elegansban ill. Arabidopsisban Célzott deléció homológ rekombinációval

  6. Célzott deléció homológ rekombinációval(molekuláris „vonalkód” tag-ek alkalmazása) a Minden Saccharomyces cerevisiae génhez egy deléciós kazettát szintetizáltak (deléciós pool). A deléciós kazettát PCR-rel hozták létre. A két végén 45 bp-nyi rész a cél gént ismeri fel. KanMX: antibiotikum rezisztancia UPTAG, DNTAG: upstream ill. downstream egyedi felismerő rész CP (Common Priming helyek): különbözőek a kereszthibridizációt elkerülendő b A deléciós pool kompettív növekedése, genomi DNS extrakció, PCR, hibridiáció (high-density oligonucleotide array) c A deléciós fenotípusok kvantitatív mérése: a szelekció során összehasonlíthatják a szignál intenzitást, ebből következtetnek a törzsek fitness-ére Átfedő ORF-eknél nem jól működik (másodlagos mutációk,életképtelenség esszenciális gének homozígóta deléciójánál)

  7. Eredmények: • Funkcionálisan releváns gének felismerése • Expresszió és funkció összehasonlítása • Drog (gyógyszer) targetek felderítése • Betegség gének meghatározása • Molekuláris evolúció tanulmányozása

  8. Inszerciós mutagenezis • Transzpozon, vagy más inszertálódó szekvencia • Random, ezért screenelés szükséges • Létrejöhet teljes, inkomplett, ill.nem funkcionális redukció az integrációtól függően • Arabidopsis, Drosophila, élesztő, C. elegans, egér

  9. Inszerciós mutagenezis • Élesztőben: transzpozonokkal mutáns fenotípusokat, génexpressziót, protein lokalizációt lehet vizsgálni • Arabidopsisban: Agrobaci T-DNS alkalmazása Hátrányai: Teljes genom feltöltés nehéz, a genom egyes régiói nem alkalmasak inszercióra, intergenikus szekvenciába inzertálódásnak nincs hatása.

  10. RNS interferencia • Legújabb technológia gén expresszió redukálásra • C. elegansban fedezték fel, hogy dsRNS szekvencia-specifikusan „elnémítja” a génfunkciót • Rövid dupla szálú RNS könnyen előállítható • Gyakran nem teljes, és a specifitás mértéke nehezen prediktálható • Mégis a legtöbb modell organizmusban működik pl: féreg (dsRNS-t produkáló plazmidokat tartalmazó E. colival etetik), Drozi, növények, emlősök

  11. Komplex jellegek genetikai feltérképezése • A genetikai térképezés sikeres volt pl. az asztma génjeinek megtalálásában • Gondosan kiválasztott populációkban több ezer polimorfizmus kutatása a szekvencia variánsok gyakoriságának felderítése céljából • A statisztikai predikciókhoz több marker kellene (kevés mintából, olcsón)

  12. A genotipizálás módszerei Egyedi DNS vonalkódot tartalmazó próba, a 2 vége komplementer a polimorf r.-t szegélyező résszel DNS hibridizálása microarray-hez: PCR amplifikált, vagy genomi DNS, tökéletes egyezés eseten erős hibridizáció a próbához Fluoreszcens polarizáció: PCR, a primer vége egy bázissal a polimorf régió vége előtt van, kiegészítve két különböző fluoreszcens dideoxi-nukleotiddal Tömegspektroszkópia: gyors, pontos Molekuláris „vonalkódok”: molekuláris inverziós próbának is nevezik, közvetlenül a genomi DNS-en végezhető, egy reakcióval SNP-k (single nucleotide polymorph, pontmutáció) ezrei analizálhatók

  13. Humán mendeli öröklődésű betegségek • Egy korábbi review szerint a több, mint 1400 ismert mendeli öröklődésű betegség gén közül: - 1%-nál kevesebb regulátoros változás - 58% missense, vagy nonsense mutáció az ORF-ekben - 30% inszerció,vagy deléció - 10% splicing variáns

  14. Polimorfizmusok felismerése mismatch-repair detektálással • Polimorfizmust tartalmazó DNS szakaszok elkülönítése a nem tartalmazóktól • PCR termék pool összekeverése lineáris vektor DNS-sel (metilált, 5bp CREdeléció) + standardok (teljes CRE, nem metilált) • Heteroduplex képződés • Heteroduplexek transzformálása E. coli törzsbe, aminek az episzómáján (genomba integrálódni képes plazmid) 2 LOX hely (ide CRE rekombináz kötödik) van, köztük tetraciklin rezisztencia (tetR) ill. streptomycin szenzitivitás (strS) gének találhatók • Ha a teszt fragmentben nincs polimorfizmus, nincs repair (5bp-nyi del./inszerció nem inditja el) tetR/strS/loxkazetta rekombinálódik, a bacik tet. szenzitívek és str. rezisztensek lesznek (a törzs str. rez. gént tartalmaz a kromoszómáján) • Ha van polimorfizmus, a javítás a CREgénre is kiterjed, így az inaktív, a sejtek tet. rezisztensek, ill. str. szenzitívek maradnak.

  15. Nagy teljesítményű fejlesztési ciklusok • 1.-2. amplifikálás (PCR) • 2.-3. miniatürizálás („single tube”) • 4. több párhuzamos nagy teljesítményű kísérlet • 5. egész genomot érintő mérések (gén expresszió, genotipizálás, knock-out analízis, protein analízis, splicing, stb.) kombinálása

  16. QTL-ek genetikai térképezése • QTL (quantitative trait loci, mennyiségi jellegek) • Nem mindig praktikus minden vizsgált gén esetében komplementációs tesztet végezni • Ezért élesztőben nagyon ígéretes eszköznek tűnik a reciprok hemizigócia (diploid genotípus, de csak egy kópiában van jelen a gén, pl. X kromoszóma génjei hím egyedben) • Ezzel a technikával egyetlen allél hatásának meghatározásával -különben egyöntetű genetikai környezetben- felismerhető egy QTL allél • A technika két diploid, heterozigóta törzs összehasonlításán alapul • Alkalmas kapcsoltság megcáfolására ill. két genom allélvariánsainak analizálására egyetlen lépésben

  17. Allél kapcsolás reciprok hemizigóciával a Két-két heterozigóta törzs genomja 1-1 allélre nézve reciprok módon hemizigóta b Molekuláris „vonalkódok” alkalmazásával az egész genom összehasonlítható c Hibridizálás után az allélvariánsok meghatározhatók, a példában a B1 allél erősebb szignált produkál, tehát domináns a B2 felett

  18. Konklúziók • A funkcionális genomika új távlatokat nyitott a biológiában, mindazonáltal még gyerekcipőben jár pl. a komplex genetikai reguláció, protein interakciók, és biokémiai reakciók terén • A modell organizmusokon végzett vizsgálatok magasabbrendű szervezetekben is hasznosak pl. humán rendellenességek kutatásában • Elterjedés a klinikumban, diagnosztikában, személyre szabott terápiában • A felfedezéseket elősegítendő a nagy teljesítményű biológiának az önálló laboratóriumokban van igazán jövője • Miniatürizálás, költségek csökkentése fontos • Különböző kísérletek (gén expresszió, genotipizálás, knock-out analízis, protein analízis, stb.) egyesítése („single tube” elképzelés ) • Mindezek megvalósításval jobb, és olcsóbb diagnosztika ill. egészségügyi ellátás (szép új jövő…:)

  19. Egyebet nem tudok elmondani… Kérem kapcsolja ki!