1 / 26

实验三 微核试验

实验三 微核试验. Dept. of Toxicology School of Public Health Xinjiang Medical University. 实验目的. 1. 学习小鼠骨髓微核试验原理. 2. 掌握微核试验的制片方法. 学习掌握微核的观察计数. 3. 掌握微核试验的结果分析评价. 4. 实验原理.

rose-jordan
Télécharger la présentation

实验三 微核试验

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 实验三 微核试验 Dept. of Toxicology School of Public Health Xinjiang Medical University

  2. 实验目的 1 学习小鼠骨髓微核试验原理 2 掌握微核试验的制片方法 学习掌握微核的观察计数 3 掌握微核试验的结果分析评价 4

  3. 实验原理 • 微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。

  4. 实验原理 • 细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。

  5. 微核试验(Micronucleus test，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。

  6. 实验原理

  7. 器材与试剂 • 器材 手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。

  8. 器材与试剂 • 试剂 • 甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1)、 pH 6.8的磷酸盐缓冲液。

  9. 器材与试剂 • 阳性对照物 • 环磷酰胺或丝裂霉素C

  10. 操作步骤 1 试验动物及处理 2 骨髓液的制备和涂片 3 观察计数

  11. 操作步骤 1、试验动物及处理 (1) 动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18~20g，7~12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。

  12. 操作步骤 (2) 染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。

  13. 操作步骤 (3) 染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。不同化学毒物诱发微核出现的高蜂时间也不尽相同。波动范围可以达到24~72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样一次就能覆盖24~72h高峰，如果高峰延迟到96h也不会漏掉。

  14. 操作步骤 (4) 剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情况下，应设3~5个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50~100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。

  15. 2、骨髓液的制备和涂片 试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺。用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。

  16. 也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨骺，用带针头的2m1注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以1000 r/min离心10min，弃去多余的上清液，留下约0.5ml与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。

  17. 操作步骤

  18. 操作步骤 3、固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中、用甲醇溶液固定15min取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。

  19. 操作步骤 4、染色 将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的Giemsa应用液(Giemsa储备液1份加PH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10~15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

  20. 操作步骤 5、观察计数 • 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀．染色较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。

  21. MN NCE Illustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus (arrow). Nuclear material appears in yellow, cytoplasm in red. Acridin-Orange staining, fluorescence microscopy, enlargement 1000 fold

  22. 结果与分析 本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的PCE/NCE比值约为 l(正常范围为0.6~1.2)。如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。

  23. 结果与分析 • 微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法(如泊松分布、二项分布、χ2检验等)均有人用于试验结果的统计分析。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。

  24. Thank You! 卫生毒理学教研室

More Related