Oversikt over oppgaven

1. Oversikt over oppgaven Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

2. Ulike mønstre av mRNA uttrykk • Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA • Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) • Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). • I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering ReferanseUkjent

3. The quantitative assay - step by step • Primer design • RNA isolation • cDNA synthesis • Set up of the experiment • Programming and running the LightCycler • Optimizing the PCR reaction • Interpretation of the results • Troubleshooting 1 2 3 4 5 6 7 8

4. Stage 1: Primer design • Length: 18-24 bp • Try to make the two primers equal in length • GC content: • Between 40% and 60% with equal GC content in both primers • Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains • Sequence: • 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences, palindromes, and highly degenerate sequences • Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C • Melting temperatures • Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. • Depends on primer sequence and buffer composition • Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value 1 2 3 4 5 6 7 8

5. 2. step: RNA isolation • Several methods • GTC metoden • Trizol metoden • Ulike kommersielle kit • Kits for cultured cells • 5 x 106 cells/prep, • expected yield: 10-20 ug/ 106 cells 1 2 3 4 5 6 7 8

6. Pre-mRNA (hnRNA) AAAAAAAAAAAAA cap mRNA Arbeid med RNA er krevendepga RNA lett degraderes • RNA er et labilt molekyl som lett degraderes • Pga 2´-OH som deltar i degraderings-mekanismen • Pga RNAser som finnes overalt (fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking). • RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA • I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein • Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet 1 2 3 4 5 6 7 8

7. Tiltak for å unngå RNA degradering • Unngå RNaser (allestedsnærværende) • Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) • Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) • Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) • Elektroforesekar behandles med H2O2 • Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer • Bruk RNase inhibitorer • DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens • Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser • Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc) 1 2 3 4 5 6 7 8

8. O C-CH2-CH3 O C-CH2-CH3 O Inhibitorer av Rnaser - DEPC • DEPC (diethylpyrocarbonate) • DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i buffere og på glassutstyr. • Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl • DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor ikke brukes under isolering. • Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris. • Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering 1 2 3 4 5 6 7 8

9. Hvordan isolerer vi RNA? • Kit for RNA isolering • The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit • Prinsipp • Celler lyseres i nærvær av guanidin thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser • Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA • RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).

10. Hvordan isolerer vi RNA? • Prinsipp forts. • Vask med lav-salt buffer • Rester av DNA fjernes med DNase behandling • Videre vask fjerner protein og rester av DNase • Høy-renset RNA isoleres i et lite volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret • Renset RNA • Har lavere DNA-innhold enn mange metoder • Er derfor velegnet for RT-PCR og real-time PCR analyser

11. 3. step: cDNA synthesisOmdanning av mRNA til cDNA • Ulike kommersielle RT-enzymer • Omniscript RT-kit (Qiagen) • Kit from Roche: Master RNA Cybergreen • Superscript (Life Technol.) 1 oligo dT mRNA 2 5´ 3´ AAAAAAAAAAAAA 5´ 3´ cap 3 mRNA RT: Reverse transcriptase 4 5 6 7 mRNA 8 Templat for Real-time PCR cDNA

12. Reaction mix for the LightCycler • Template DNA • cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50 • Primers • 0.3-1.0 uM of each primer • MgCl2 • 1-5 mM • Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase • Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I 1 2 3 4 5 6 7 8

13. Samples to run • A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene • Using a subclone of the target • Sample (cDNA) with primers for target gene • In the form of cDNA made from the isolated RNA • Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes 1 2 3 4 5 6 7 8

14. Standard curve • Use at least 3 concentrations for a standard curve • Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,... • For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient 1 2 3 4 5 6 7 8

15. Programming the Lightcycler 1 2 3 4 5 6 7 8

16. Programming the Lightcycler • Preincubation • Denaturation • Amplification • Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run) • Melting curve • Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp • Cooling • Edit samples 1 2 3 4 5 6 7 8

17. Optimization - an important step • Finding optimal MgCl2 • Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope • Annealing temperature? • Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of annealing temp • Controls - positive and negative • Always include a NTC (non template control, here water) to see primer-dimers • Also include a positive control to see that the reaction works 1 2 3 4 5 6 7 8

18. Optimizing PCR conditions • Template dilution • Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range • Programming • Annealing temp, elongation time • Improve your primer design? • If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long optimalization experiments) 1 2 3 4 5 6 7 8

19. Interpretation of the results • Quantification by one or several standard curves • Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample • Assumption: housekeeping gene expression = constant in the samples • Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed housekeeping genes 1 2 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb= 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb= 0.107 HeLa/PP1

20. Interpretations of the results • Evaluation Parameters • Error < 1 • r = -1.00 • Slope • Melting curve analysis • Primer dimers • Expected melting point • Calculations 1 2 E = 10 -1/slope E = 10 -1/-3.407 = 1.97 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb= 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb= 0.107 HeLa/PP1 22 fold

21. Troubleshooting:Problem 1: primer dimers • Primer-dimers interferes with quantitation • LC with SYBR-green measures all DNA produced • Primer-dimer is a template-independent product that also produces fluorescence • Identifying primer-dimers: melting curve analysis • Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak 1 2 3 4 5 6 7 8

22. How to avoid primer/dimers? • General approaches • Reduce delays in workflow • Optimize primers - may be more important with LC than in conventional PCR • Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. • Use hot start • inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure • LC-specific approaches • Increase the temperature for fluorescence registration • Use of hybridization probes rather than SYBR-green • Reduce number of cycles, e.g. to 40. 1 2 3 4 5 6 7 8

23. Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA • Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps • Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility 1 2 3 4 5 6 7 8

24. How to avoid problems with genomic DNA? • Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure • Included in the kit used here • Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA • Used as the first experiment here 1 2 3 4 5 6 7 8

25. Mandag Forsøk 1 • ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

26. Tirsdag Forsøk 1 • ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

27. Ulike mønstre av mRNA uttrykk • Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA • Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) • Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). • I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering ReferanseUkjent

28. Criteria for single standard curve • Equal Efficiency Required for Accurate Analysis • Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget • Efficiency depends on: • - fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp) • - intervening sequence • - spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene

29. Prerequisites of a suitable housekeeping gene • RNA-specific detection • pseudogene free • amplification / detection specific for active target • No regulation of expression level in the system analysed • normal vs. tumor tissue • unstimulated vs. stimulated cells • Similar expression level compared to the target analysed

30. Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor g-actin multigene family; pseudogenes GAPDH multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer mostly pseudogenes : insulin, EGF 5.8S,18S, 28S RNA pseudogenes ß2-microglobulin no pseudogenes: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors G6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors PBGD no pseudogenes aldolase pseudogenes HPRT pseudogenes U3, U8, ... Pseudogenes ornithin : tumors decarboxylase ... Housekeeping Genes