第三节蛋白质的理化性质及其分离纯化

第三节蛋白质的理化性质 及其分离纯化一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应

（一）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。

蛋白质的等电点（pI） • 概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 • pI是蛋白质的特征性常数。 • 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。

pH > pI 带负电荷 • pH < pI 带正电荷 • 体内多数蛋白pI为5.0左右， pH为7.45 时多数蛋白带负电荷。 • 如pI 偏于碱性－碱性蛋白质鱼精蛋白组蛋白 • 如pI 偏于酸性－酸性蛋白质胃蛋白酶丝蛋白

（二）蛋白质的胶体性质 • 颗粒大小：在1～100nm之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。 • 稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷不通透性：半透膜毛细血管壁

（三)蛋白质的变性、沉淀和凝固 1.变性（denaturation） • 概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。 • 变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。

核糖核酸酶

变性因素： 物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、 SDS -巯基乙醇、重金属离子生物碱试剂

蛋白质变性后的理化和生物学性质改变： 溶解度↓ 生物活性丧失及易被蛋白酶水解粘度↑ 结晶能力消失、 • 应用：消毒灭菌低温保存生物制剂

复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。 • 不可逆变性 2. 沉淀 (precipitation) • 蛋白质的沉淀：蛋白质的肽链相互聚集而从溶液中析出的现象。

+ • + • - • - • + • - • + • + • - - • + • - • + • - • + • - （沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）蛋白质胶体颗粒的沉淀

蛋白质的凝固作用（coagulation） • 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将 pH 调至pI，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。

（四）蛋白质的紫外吸收 • 波长：280nm • 引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸和酪氨酸( Trp, Tyr)的共轭双键。 • 可用于蛋白质的定量

（五）蛋白质的呈色反应 • 茚三酮反应：肽和氨基酸的自由氨基与茚三酮生成蓝紫色化合物。 • 双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。 • 呈色反应可用于蛋白质的定性和定量。

二、蛋白质的分离和纯化 （一）丙酮沉淀及盐析（二）电泳（三）透析（四）层析（五）分子筛（六）超速离心

（一）丙酮沉淀及盐析 原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。 • 丙酮沉淀：0～4℃，10倍于蛋白质体积的丙酮，沉淀后立即分离。 • 盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水溶液中的稳定因素，而使之从溶液中沉淀析出的现象。

（二）电泳（electrophoresis） • 蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。 • 由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。 • 应用：分离蛋白质和测分子量

（三）透析（dialysis） • 蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。 • 如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的目的。 • 应用：除盐和浓缩

超滤 • 利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。 • 超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。

（四）层析（chromatography） • 离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离目的。 • 应用：分离蛋白质

阴离子 交换树脂

（五）分子筛 • 根据多孔载体对不同大小，形状的蛋白分子的排阻能力不同而将各个组分分开的一种层析，又称凝胶过滤层析。 • 应用：分离蛋白质、除盐

（六）超速离心（ultracentrifugation） • 不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。 • 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（S）表示。

S与蛋白质大体上和分子量成正比关系。 • S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。 • 应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。

多肽链AA序列分析改进的Sanger法 • 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。 • 测定多肽链的N-端与C-端的氨基酸残基。 • 把肽链水解成肽段，再分离纯化肽段。 • 测各肽段的氨基酸排列顺序。 • 经过组合排列对比，得出完整肽链中氨基酸顺序。

水解肽链的方法及特征

通过核酸推演的方法 分离编码蛋白质的基因测DNA序列排列出mRNA的序列按照三联体密码推演出氨基酸的序列

本次课重点 • 蛋白质的三、四级结构 • 蛋白质的pI • 维持蛋白质胶体稳定的因素 • 蛋白质的变性 • 蛋白质的紫外吸收 • 蛋白质分离纯化的方法及基本原理

复习题 1.名词解释：肽单元模序结构域蛋白质的一、二、三、四级结构 2.蛋白质的基本组成单位是什么？有多少种？按侧链的结构和功能不同可分为几类？各包括哪些氨基酸？ 3.蛋白质的二级结构有几种？各有何特征，由什么化学键维持？

第三节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化