1 / 20

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VIII. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF) EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA. ALAPELV

samuru
Télécharger la présentation

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VIII. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF) EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

  2. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA • ALAPELV • Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített • különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek • Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibiliskölcsönhatásokat képeznek. • A hordozó szemcsék anyaga (mátrix) lehet: • - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose) • cellulóz • - Organikus polimerek: • poliakrilamid • hidroxialkil metakrilát (Spheron) • etilénglikol metakrilát (Fractogel) • - Kevert fázisok (agaróz-poliakrilamid)        (Ultrogel) • - Szilikagél, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

  3. Az affinitási kromatográfia kölcsönhatásainak tükörképi elve

  4. AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES) IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)

  5. AAT Glicin-HCl puffer, pH: 2,8 perc

  6. LECTIN-affinitási kromatográfia lektinek affinitási kölcsönhatásai glikoproteinekkel - glikánokkal • N-glikozid kötésben • Lectin-AAA • Lectin-DSA • Lectin-GNA • Lectin-MAA • Lectin-SNA • Lectin-PHA-L • Szerkezet specificitás • L-Fuc(l-6)GIcNAcl • Galβ(l-4)GlcNAc- • Man (l-3)62 Man- • SA (2-3)Gal • SA (2-6)Gal • Poly-Gal-GlcNAc- • O-glikozidos kötésben • Lectin-ACA • Lectin-PNA • Lectin-ConA • Lectin-RCA-120 • Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

  7. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents

  8. Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

  9. FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

  10. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS • FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A • AFFINITY PACKING MATERIALS: • (Capacities  10 mg albumin per ml gel) • ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) • ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad) • ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M • COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) • CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) • ELUTION: • Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer • pH: 5.8 or 6.8 • Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer • pH:8.0 containing 2 M NaCl • FLOW RATE: 1 ml / min • SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 • Equivalent to 50 μL of original serum

  11. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25

  12. FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

  13. PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

  14. PSEUDO-URIDINE DETERMINATION • PRINCIPLE • NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. • SAMPLE PREPARATION • MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY • COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. • HPLC ANALYSIS • HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., • COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. • DETECTION: 254 nm.

More Related