微生物与环境检测实验 —— 多管发酵法测量水中大肠菌群

1. 微生物与环境检测实验——多管发酵法测量水中大肠菌群微生物与环境检测实验——多管发酵法测量水中大肠菌群 一、目的要求 1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法 2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性

2. 若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中易死亡、易变异，数量少，难检测，这就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是：粪便中大量出的非病原茵，易检出。若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中易死亡、易变异，数量少，难检测，这就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是：粪便中大量出的非病原茵，易检出。 最广泛应用的指示菌是大肠菌群，其特点： 好氧和兼性厌氧； 革兰氏阴性； 无芽胞的杆状细菌； 在乳糖培养基中37℃培养24～48h能产酸产气。 我国规定每升自来水中≤3个； 加氯消毒即供饮用水的水源水≤ 1 000个； 净化及加氯消毒后供饮用水的水源水≤ 10 000个。 二、基本原理

3. 检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用。多管发酵法包括：初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用。多管发酵法包括：初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。 1．初步发酵试验利用大肠菌群能发酵乳酸而产酸产气的原理来检测。乳糖能起选择作用；德汉氏小管收集产生的气体；溴甲酚紫作为pH指示剂，产酸后即由紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

4. 1、平板分离 平板分离使用EMB(伊红美蓝琼脂培养基)。大肠菌群发酵造成酸性环境时，EMB中伊红与美蓝作为指示剂，结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色(龙胆紫)菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划成分离菌落。 2、复发酵实验 以上大肠菌群阳性的菌落的，再通过与第一步相同的原理来进一步确认。

5. 三、实验器材 1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管(内有倒置小套管)， 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 (内有倒置小套管)， 伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪 器：干热灭菌锅，高压蒸汽灭菌锅，洁净工作台，培养箱，灭菌吸管，灭菌试管，培养皿，灭菌三角瓶。

6. 四．操作步骤 1．培养基配置 (1)．乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml 调pH至 7.2～7.4 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 充分混匀，分装于有小倒管的试管中。115℃灭菌20min。 (2)．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 具体配置方法同上，除水以外每组分量为原来3倍。

7. (3)．伊红美蓝培养基：(EMB培养基) 称取伊红美蓝琼脂干粉35g，加热溶化溶解于1000ml水中，116℃灭菌30min。灭菌后，冷却至60℃左右时倒平板备用。 每升中含以下成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 2% 伊红水溶液 20ml 0.65% 美蓝水溶液 10ml 琼脂 15g

8. 2．自来水检查 (1)．水样的采取：火焰烧灼水龙头3min灭菌，放水5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待分析。 (2)．初发酵试验：在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。混匀后，37℃培养24h。24h未产气的继续培养至48h。 (3)．平板分离：经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂干板上。再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片。革兰氏染色，镜检。 ①．深紫黑色、有金属光泽 ②．紫黑色、不带或略带金眉光泽 ③．淡紫红色、中心颜色较深

9. (4)．复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分。重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管(瓶)数查表2.3，即得大肠菌群数。

10. 3．池水．河水或湖水等的检查 (1)．水样的采取：取距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入，然后翻转过来，除塞后盛满水样，再从水中取出，即得所测水样。须及时检测，否则应放入后冰箱中保存。 (2)．初发酵试验 ①．将水样稀释成10-1、10-2。 ②．分别吸取1ml 10-1、10-2的稀释水样和1ml原水样各注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中，另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。 ③．混匀，37℃培养24h，观察细菌产酸产气情况。 (3)．平板分离实验 将产酸产气(阳性)发酵管分别接种于EMB上，37℃下培养18～24h，观察是否为阳性菌落。 (4)．复发酵实验：（同上），查表2-4，2-5。

11. 五．实验结果 1．自来水 100 ml水样的阳性管数是多少？10 ml水样的阳性管数是多少?查表－2.1得每升水样中大肠菌群数是多少? 2．池水、河水或湖水 阳性结果记“+”，阴性结果记“-”。 查表－2.2得每升水样中大肠菌群数是多少? 查表－2.3得每升水样中大肠菌群数是多少?

12. 实验日程安排周一 1、领取器材 500ml三角瓶 ×1 （取自来水） 150ml具塞三角瓶× 1 （取湖水） 250ml三角瓶×4（1个无菌水、2个自来水初发酵、1个湖水初发酵） 试管 × 25（10支自来水初发酵，4支湖水初发酵，3支配湖水梯度，8支预留复发酵） 9cm培养皿 ×8 （预留复发酵） 1ml移液管 ×3 （配湖水梯度用） 10ml移液管 ×3（1支配培养基用，1支自来水，1支湖水） 试管架 ×1 记号笔 × 1

13. 2、配培养基 （1）普通浓度蛋白胨培养基 200ml 每支试管分装10ml，装入德汉氏小管，共10支。其中3支湖水初发酵，7支预留复发酵。 （2）3倍浓度蛋白胨培养基 400ml 1> 每个250 ml三角瓶中分装50ml，装入德汉氏小管，共3个。其中2个自来水初发酵，1个湖水初发酵。 2 >每支试管分装5ml，装入德汉氏小管，共11支。其中10支自来水初发酵， 1支湖水初发酵。 （3）无菌水 250ml三角瓶中装入蒸馏水150ml，灭菌待用。

14. 3、灭菌 （1）干热灭菌 培养皿 ×8 1ml移液管 ×3 10ml移液管 ×3 500ml三角瓶 ×1 150ml具塞三角瓶 × 1 （2）湿热灭菌 试管×25 250ml三角瓶 ×4

15. 周二：初发酵实验 1、采样 自来水 湖水（九曲桥） 2、接种 （1）自来水 2个50ml三倍培养基三角瓶中分别接100ml水样 10支5ml三倍培养基试管中分别接10ml水样 （2）湖水 1个50ml三倍培养基三角瓶中接100ml水样 1支5ml三倍培养基试管中接10ml水样 3支10ml普通培养基试管中分别接入10-1稀释、10-2稀释、原水样各1ml 3、培养：37摄氏度培养箱中培养 4、配EMB培养基 100ml，装入250ml三角瓶中灭菌。取出后在洁净工作台上倒入无菌培养皿中，制成EMB平板

16. 周三：平板分离 1、观察24h初发酵实验结果，并记录产酸产气结果。未产酸产气的继续培养至48 h。阳性管记“+”，阴性管记为“-”。 2、初发酵阳性管划线接种到EMB平板中，37度倒置培养。 周四：观察平板分离结果，染色，复发酵实验 1、取培养24h的EMB平板观察，挑选出具有以下特征的菌落 ①．深紫黑色、有金属光泽 ②．紫黑色、不带或略带金眉光泽 ③．淡紫红色、中心颜色较深 2、挑取符合特征的菌落其中一小部分做革兰氏染色观察，是否为革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，是则记为阳性。 3、在阳性平板中挑取涂片观察过的菌落1-3个接种到复发酵培养基中。

17. 周五：观察复发酵结果 1、观察复发酵结果，确认阴性或者阳性。 2、查表计算出水样中大肠菌群数量。 3、清洗平板、试管等实验器材并归还。 周六 个别初发酵需48h的观察实验结果